碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展

程玉谦 王悦

天津医科大学第二医院感染疾病科（天津 300211）

肺炎克雷伯菌是临床常见的革兰氏阴性病原菌，获得对抗生素的多重耐药性和拥有高毒力已成为其两种不同进化方向。前者是导致院内感染的主要病原菌，通过获得耐药基因尤其是超广谱β内酰胺酶（ESBLs）或碳青霉烯酶导致多重耐药；而后者对大多数抗菌药物敏感，毒力强，常导致危及生命的侵袭性感染如肝脓肿和眼内炎等。以往认为这两种克隆株是独立进化，但是自从2014年报道多重耐药的高毒力肺炎克雷伯菌（MDR-hvKP），面对抗生素选择压力，越来越多的整合高毒力和多重耐药表型的临床株被检测到并且作为“超级细菌”引起全世界的关注，尤其是碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP），给临床治疗带来极大挑战，甚至导致医院内的爆发流行。为了更好地了解这种“超级细菌”并制定高效可行的防治策略，本文针对其流行病学特点及耐药机制做一综述。

1 流行病学特点

通过比较七个管家基因的等位基因序列，多位点序列分型（MLST）可以将肺炎克雷伯菌群体构建成谱系，即序列类型（ST）。肺炎克雷伯菌的高耐药和高毒力表型具有自己独特的克隆谱系。全球已报告碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌（CRKP）中，ST11克隆主要在中国和南美流行，ST258主要在美国报道，ST512在意大利和希腊流行，ST147主要在印度和突尼斯报道。同时高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）主要集中于ST23，ST65和ST86克隆背景［1］。近年来，有关CR-hvKP临床株的报道陆续出现并逐渐增多。2014年CEJAS等［2］报道了美国首次分离的产KPC-2的ST23型CR-hvKP的菌株。2016年ZHANG等［3］报道了我国浙江省从住院患者中分离出的5株携带blaKPC-2的ST23/K1型CR-hvKP克隆株和少见的ST1797克隆株。我国CR-hvKP的流行病学分析显示80%的CR-hvKP菌株属于产KPC-2的ST11型。ST11-CR-HvKP具有高传播性，高耐药性和高毒力，对人类健康构成严重威胁，我国是流行率最高的国家［4-5］。尽管流行病学研究显示在我国KPC是CR-hvKP最常见的碳青霉烯酶，携带NDM，VIM，OXA和IMP的CR-hvKP也陆续被报道［11-14］。同时我国也出现其他ST型CR-hvKP。近期 ZHU等［15］首次报告了由一种新型ST克隆：ST859-K19 CR-hvKP临床分离株导致的上海教学医院感染暴发，利用WGS数据建立的系统图显示所有11株CR-hvKP菌株具有几乎相同的耐药基因图谱（blaKPC-2、blaTEM-1B、blaSHV-187、rmtB、fosA6）和毒力基因图谱（rmpA、rmpA2、iucABCDiutA），属于同一克隆传播，这一观察结果提示在肺炎克雷伯菌中，编码可移动遗传元件的耐药基因和毒力基因正在向更多的ST型传播，因此需要进行大规模和广泛的流行病学监测，以深入研究CR-hvKP的进化。 ZHAO等［16］首次报道了从华西医院一位ICU重症感染患者的痰液中分离的一株ST592的CR-hvKP菌株，这是一种少见的与高毒力和碳青霉烯耐药性相关的ST型，突出了CR-hvKP的不同克隆背景。

除我国，包括美国、英国、阿根廷、日本和加拿大在内的众多国家陆续报道CR-hvKP［1］。随着毒力基因和耐药基因的传播，菌株的克隆背景呈现多样性，已经报道了越来越多的序列类型（ST）的CR-hvKP 分离株，包括 ST11，ST14，ST23，ST25，ST36，ST65，ST86，ST1797，ST43，ST231，ST147，ST15，ST383，ST268，ST595，ST375，ST48和 ST307等［6-9］，其所携带的碳青霉烯酶包括 KPC-2，NDM（NDM-1，NDM-5和NDM-7），IMP，SIM，VIM（VIM-1和VIM-2）和OXA-48等［10］。对GenBank中可用基因组序列的分析也证实携带毒力质粒的CRKP已经传播到世界其他地区，对公众健康构成了巨大威胁，全球需立即采取行动阻止这种危险微生物的传播［5］。

2 耐药机制

CR-Hvkp主要是通过移动遗传元件在细菌中转移耐药基因和毒力相关基因，这些遗传元件包括质粒、整合接合元件（ICE）、整合子、插入序列（IS）和转座子。目前文献报告的CR-hvKP菌株通过以下三种模式产生。

2.1 捕获耐药基因或发生染色体基因突变 hvKP谱系（如ST23/ST86/ST65）通过移动遗传元件获得碳青霉烯酶基因或在染色体上发生基因突变。其机制主要包括通过分子间复制转座由毒力质粒捕获耐药基因、获得可接合的耐药质粒、获得具有未知接合转移机制的耐药质粒以及通过其他未知机制获得耐药基因。

hvKP菌株获得携带碳青霉烯酶基因的质粒是报道最多的机制，耐药基因主要包括blaKPC-2，blaNDM-1，blaOXA-48，blaVIM-1，blaVIM-2 和blaIMP-6；其中，blaKPC-2和blaNDM-1最为普遍。HvKp获得碳青霉烯耐药基因具有地域性。例如，NDM和OXA在印度很常见，因此近年来在该地区出现了产NDM和OXA的CR-hvKP菌株。同样OXA-48在法国流行，RACHA等［17］在一位泌尿道感染患者中分离出一株CR-hvKP即Kpn154，含有IncL型pOXA-48样质粒和IncHI1B/IncFIB型pVIRKpn154，Kpn154是由K2/ST86 Hvkp通过编码碳青霉烯酶OXA-48质粒的转化而产生。加拿大、美国和英国也报道了以类似机制进化的产KPC-2的K2/ST86分离株以及产KPC-2和NDM的K1/ST23分离株［18-20］。在我国，2016年ZHANG等［3］报道了浙江省住院患者中分离产blaKPC-2的K1/ST23型和少见的ST1797型CR-hvKP克隆株。YAN等［21］从浙江省一例患有COPD的老年患者痰液中分离出ST23/K1型CR-hvKP菌株ZJ27003，其含有携带blaKPC-2的IncP1质粒p27003_KPC可以转移至铜绿假单胞菌PAO1并使受体对碳青霉烯具有耐药性，提示这种携带和传播blaKPC-2基因的CR-hvKP分离株对公共健康造成严重威胁。除了获得可传播的接合质粒外，hvKP菌株的毒力质粒也可以通过分子间的转座整合抗生素耐药基因。介导这种转座的移动元件靶向毒力质粒上的相关热点，导致耐药基因和称为靶点重复（TSD）的重复热点序列的整合。2018年我国首次报道了携带blaKPC-2的毒力杂合质粒的CR-hvKP临床株：一株K1/ST23 CR-hvKP临床株KP70-2，其含有的质粒pKP70-2是pLVPK样毒力质粒，除了位于遗传保守质粒骨架内的额外MDR编码区，与其他hvKP菌株携带的各种已知的毒力质粒几乎在结构上相同。MDR编码区含有移动元件，包含抗生素耐药基因dfrA14和blaKPC-2，该MDR区域侧翼为两个相同方向的IS26拷贝，与靶位点重复的外部8bp（CTAAAATT）产物连接，表明插入事件是通过IS26介导的分子间复制转座将多药耐药区域整合到毒力质粒［22］，这将导致严重的公共卫生问题。

同时，通过染色体突变获得碳青霉烯耐药性的hvKP虽然很少但也有报道。如2016年印度报道的K2/ST14型hvKP菌株 U25，其ompK36在134位氨基酸处插入了甘氨酸和天冬氨酸，这种突变导致膜通透性改变，阻碍抗生素进入细胞产生对亚胺培南的耐药性，在U25的质粒（包括blaOXA-9，blaCTX-M-15和blaSHV-11）和染色体（blaOXA-1和blaSHV-28）中发现了多种β-内酰胺酶耐药基因，但是没有检测到碳青霉烯酶［23］。早在2015年我国的一项回顾性研究中发现一株ST65/K2临床株由于产生ESBL和减少OmpK35/36的表达而表现出对碳青霉烯类的高耐药性，但不产生碳青霉烯酶［24］。

2.2 获得毒力相关基因 CRKP分离株获得毒力质粒，如获得pLVPK样毒力质粒的ST11 CR-hvKP。获得毒力相关基因涉及三个主要机制：（i）通过与由同源重组介导的辅助接合质粒共整合来获得毒力质粒；（ii）通过同源重组获得含有毒力基因的接合质粒；（iii）携带毒力因子的ICE元件的染色体整合。同源重组在高毒力相关基因的传播中起着关键作用。相比上述hvKP克隆株获得耐药基因，这些CRKP谱系可能更容易获得毒力基因或毒力质粒［25］。最具特征的毒力质粒是来自K1/ST23菌株NTUH-K2044的224 kbp质粒pK2044；来自K2/ST86菌株CG43的219 kbp质粒pLVPK和K2/ST66菌株Kp52.145的121 kbp质粒Kp52.145pII，其中毒力相关的位点和基因是高度保守的［26］。CR-hvKP的高毒力主要包括rmpADC和rmpA2（粘液表型调节子），以及编码iucABCD-iutA的气杆菌素和编码iroBCDN的沙门菌素，因为缺乏包含tra基因的完整接合模块，以往认为毒力质粒如pLVPK是非结合的［26］。近年来，越来越多的证据表明pLVPK样毒力质粒能够传播和增强CRKP的毒力［28］。YAO等［29］从河南省临床患者中筛选出4株ST11-CRHvKP菌株，每株菌株均携带KPC-2编码质粒和毒力质粒，毒力质粒的进一步测序显示与pLVPK高度同源。GU等［28］报道了浙江省一所医院ICU发生的ST11-CR-HvKP菌株导致呼吸机相关肺炎的流行，除了携带blaKPC-2基因的接合MDR质粒外，致病菌株还获得了大约170 kbp的pLVPK样毒力质粒，这5位患者死于严重肺部感染、多器官衰竭或感染性休克。随后，DONG等［30］分析了上述三种ST11 CR-HvKP分离株的全基因组序列（WGS），它们各自携带五种质粒，包括一个178 Kb的IncHI1B/FIB型携带rmpA2的毒力质粒，一个177.5 Kb的IncFII/R自转移的携带blaKPC-2 MDR质粒，一个99.7 Kb的Incl1质粒和两个大小分别为11.9 Kb和5.6 Kb的ColRNAI型质粒。非接合的毒力质粒和携带blaKPC-2的MDR接合质粒之间存在同源区域，这表明毒力质粒从ST23 hvKP到ST11 CRKP的传播可能是通过这两种质粒的共整合转移介导的。这标志着一个令人担忧的进化事件—质粒介导的多药耐药性和高毒力的融合，因为它们同时具有高毒力、多药耐药性和高度传播性，对人类健康造成严重威胁，应采取控制措施，防止其在医院和社区的进一步传播。

YANG等［31］探讨了ST11 CR-Hvkp获得毒力质粒的分子机制，即通过同源重组和插入序列IS26和IS903B在毒力质粒、Incl1型接合辅助质粒和小ColRNAI质粒之间形成融合质粒的事件介导的。融合事件将导致肺炎克雷伯菌产生新的毒力因子，并加强这些毒力因子的传播，这一发现为克雷伯菌毒力质粒传播的遗传机制提供了新的见解。含有铁载体生物合成基因的种属特异性整合和结合元件ICEKp在肺炎克雷伯菌的进化中起着重要作用，ICEKp的水平转移为毒力因子的传播提供了重要机制。SHEN等［32］报道了ST35/KL108 CR hvKp分离株是通过获得携带blaNDM-5的质粒并整合位于染色体上的约76 Kb的含有iroBCDN和rmpA基因的ICEKp1元件而进化。这也是有关ST35型产NDM-5的CR hvKp出现ICEKp1染色体整合的首次报道。

WU等［33］通过GenBank数据库检索了1980年至2022年间105个国家的21 016株CRKP的基因组序列，研究了CRKP的基因组特征，包括克隆谱系、碳青霉烯酶基因、毒力基因以及荚膜和脂多糖类型，发现我国大部分Hvkp与优势CRKP克隆相关，提示CRKP的经典菌株已经开始进化成高毒力菌株，因此提出鉴于CR-hvKP在全球范围的播散，应实施由WGS支持的实时监测和严格的感染控制措施。

2.3 单个质粒中毒力基因和碳青霉烯耐药基因的融合 大多数已知的融合过程由插入序列元件通过同源重组介导。2018年我国学者报道的K1/ST23型CR-hvKP的杂合质粒pKP70-2最为经典，携带毒力基因rmpA2和blaKPC-2，blaKPC-2位于非Tn4401元件中，称为NTEKPC-Id，结构为IS26-△tnpR-ISKpn8-blaKPC-2-DISKpn6-IS26［22］。2018年TURTON等［34］分析了携带碳青霉烯酶基因的序列类型（ST）15，48，101，147和383“高风险”克隆株中的毒力质粒，在菌株KpvST383_NDM_OXA-48，Kpv_ST383_S1和KpvST 48_NDM发现了三种携带毒力片段和blaNDM-5的杂交质粒，全基因组测序分析提示这些杂交质粒是通过IS介导的重组产生的。高毒力菌株能够通过将IGE，主要是IS介导的MDR区整合到其内在毒力质粒中来获得MDR决定簇，构成了具有保守毒力区和新获得的MDR编码位点的双重特征的镶嵌质粒，但可能不是接合的。然而，如果将编码自转移接合系统的基因与耐药决定簇一起整合到毒力质粒中，则将赋予杂交质粒自传递性和接合性。或者借助于其他结合质粒，可以将该杂合质粒转移。因此，如果不考虑进入宿主细菌的适应性成本，它们能够将耐药性和毒力基因一次性转移到任何类型的肺炎克雷伯菌克隆中，以促进MDR hvKP尤其是CR-hvKP的出现。此外，如果IGE进一步将来自高毒力质粒的毒力位点/基因携带到其他耐药质粒中，则形成了具有大多数耐药质粒特征的杂交质粒。它们可以被转移到hvKPs或cKPS中，从而形成由它们的接合转移系统介导的MDR hvKPs。在ST11 K64 hvCRKP菌株中发现了一种杂合质粒，即pCRHV-C2244，该质粒由pLVPK样毒力质粒和IS26介导转座而携带blaKPC-2的IncFII/IncR质粒融合而成［35］。由于缺乏tra基因，pCRHV-C2244本身没有结合，但在辅助接合质粒存在下，可以由大肠杆菌以10-10的低频率转移到肺炎克雷伯菌ATCC 13883［38］。最近发现，在ST86 hvCRKP中，非接合的pLVPK样质粒可通过275 bp短区的同源重组与携带blaKPC2的接合质粒融合，从而实现两种质粒作为单个实体的接合转移［36］。文献已经证明重组可以发生在非常短（＜ 100 bp）的同源序列之间［37］。ZHAO等［16］在一株ST592的CR-hvKP菌株中观察到pLVPK样毒力质粒可以通过重组在接合过程中与携带blaKPC2的IncFII大接合质粒融合，这种重组很可能发生在短至43 bp的同源区域之间。

此外，毒力基因可以通过肺炎克雷伯菌衍生的外膜囊泡（OMV）水平转移。OMVs可以介导毒力质粒phvK2115的种内和种间水平转移，也可以同时将两种耐药质粒转移到肺炎克雷伯菌和大肠杆菌受体菌株中。OMVs介导的phvK2115的水平转移使得肺炎克雷伯菌中的毒力和碳青霉烯类耐药基因共存，导致CR-hvkp的出现，这是一种重要的质粒转移机制［38］。

3 临床问题

3.1 环境定植 FRENCKEN等［27］研究表明G-菌的肠道定值增加了ICU患者出现菌血症的风险，对G-菌肠道定植的常规监测具有临床意义。CR-hvKP具有肠道定植的能力，这些菌株传播的风险很高，有可能导致严重感染。在一项针对低收入国家孕妇肺炎克雷伯菌肠道携带的流行病学研究中，提示环境暴露因素包括食物、动物接触或家庭成员住院，同时发现了孕妇MDR HvKp的肠道定植［39］，甚至在即食蔬菜中检测到ST23 CRKP菌株［40］，这不仅仅是食品安全问题，而是公共卫生威胁。ZHENG等［41］针对教学医院腹泻住院患者进行筛查，发现产碳青霉烯酶的肠杆菌目（CPE）细菌的携带率为12.4%，其中KP最常见（65/87），以ST11型（58/65；89%）为主，S1核酸酶PFGE（S1-PFGE）和Southern印迹分析显示ST11 CR-HvKP分离株携带至少四种类型的rmpA-和rmpA2-阳性质粒，大小范围从约146 kb到约218 kb，粪便可能是ST11-CR-HvKP菌株的来源，有必要进一步研究ST11-CR-HvKP直肠定植与临床感染之间的关系。

3.2 CR-hvKP院内爆发对感控的挑战 CR-hvKP在医疗环境中的快速传播和爆发对感染控制提出了巨大挑战。高水平的耐药性和致病性往往导致不良的临床结果。2016年从我国ICU病房分离出21株产生KPC-2的ST11型CRKP菌株，它们来自同一克隆并获得了pLVPK样毒力质粒，导致5名患者在住院期间死亡［28］。OUYANG等［42］针对2018年湖南省一家医院分离的CRKP进行的回顾性研究，发现产生ST11 KPC-2的CR-hvKP在院内广泛存在，并且出现了ST11-KL64和ST11-KL47的两个重要谱系的克隆传播。因此迫切需要开发新的快速方便的方法来准确区分高毒力肺炎克雷伯菌和经典肺炎克雷伯菌，以便进行精确治疗并阻止CR-hvKP的传播。同时，产生一种以上碳青霉烯酶的CR-hvKP菌株已经出现。LIU等［43］从我国烧伤创面感染患者中分离出同时产生NDM-1和KPC-2的ST86/K2肺炎克雷伯菌菌株。近年意大利报道了从住院患者分离出同时产生OXA-48，NDM-1和NDM-5的新型高毒力XDR肺炎克雷伯菌克隆KP52-19，OXA-48与NDM-1和NDM-5在单个菌株中的三种不同质粒上的共存，导致血流感染［44］，由于遗传元件的高迁移率以及由此所致质粒的高重组率，在医院环境中可能导致流行的杂合耐药性/毒力的质粒克隆谱系的传播，监测新出现的克隆型肺炎克雷伯菌中毒力/耐药性质粒的传播具有绝对重要性，这给临床管理、感染控制和抗菌药物的应用带来巨大的挑战。

总之，在过去的几十年里，肺炎克雷伯菌不断进化演变，成为高毒力和/或多药耐药菌株。尤其值得关注的是，CR-hvkp已在全球范围内传播，对人类健康构成重大威胁。这些菌株通过MDR克隆获得毒力基因或通过hv克隆发展MDR表型而进化，进化事件主要涉及基因突变的累积和水平基因转移，这需要做更多的研究深入理解这种“超级细菌”，从而设计可行的方法来根除或阻止菌株的进一步进化和播散。