miR-203a-3p抑制人肝癌细胞系增殖

2023-01-18黄驿胜叶启文王竞枫

基础医学与临床 2023年1期

黄驿胜，叶启文，王竞枫

宁德市闽东医院 1.普通外科； 2.心血管内科，福建宁德 352000

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上常见的癌之一，亚洲和非洲的发病率最高[1]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)在调节癌细胞的增殖、迁移、存活和化疗敏感性中发挥重要作用[2]。MRNAs在癌诊断及预后中的潜在应用前景仍很乐观，但其价值仍有待确定，其促进或抑制肿瘤发生的潜在机制尚不完全清楚。MiRNA是HCC发展和进展的关键参与者和调节因子，在HCC中miRNAs的关键调控过程包括增殖、凋亡、侵袭、转移、上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、血管生成、耐药和自噬[3]。既往研究证实miR-203a-3p在许多肿瘤中表达水平低，它可以调节肿瘤细胞的分化、增殖和凋亡，并通过调控靶基因参与肿瘤细胞的侵袭转移[4]。本研究采用慢病毒感染模型实现HepG2细胞中miR-203a-3p的过表达，分析miR-203a-3p对HepG2细胞增殖、凋亡、克隆和迁移的影响，以及对HCC细胞基因表达谱的影响，为miR-203a-3p在HCC中的功能研究及其在细胞癌变中的相关机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及试剂：人肝癌细胞系(HepG2、Huh7、SMMC-7721、Bel-7402)和正常人肝细胞系(LO2)(中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mol/mL链霉素、Trizol试剂和第一链cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；FFPE RNA 纯化试剂盒(Norgen Biotek公司)；RNAiso小RNA提取试剂[宝日医生物技术(北京)有限公司]；SYBR select master mix试剂盒(Hoffmann-La Roche有限责任公司)；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)ELISA试剂盒(R&D Systems公司)；全蛋白提取试剂盒、BCA(2,2-Biquinoline-4,4-dicarboxylic acid二钠盐)蛋白质含量试剂盒和电化学发光 (electrochemiluminescence, ECL)检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；抗TGF-β1和抗GAPDH单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；抗TGFβR1单克隆抗体[艾博抗(上海)贸易有限公司]；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)细胞增殖试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司)；人源TGF-β1重组蛋白(亚诺法生技股份有限公司)；引物(是生工生物技术有限公司)；miR-203a-3p慢病毒载体(上海汉恒生物技术有限公司)。

1.1.2 组织标本：HCC组织标本取自2017年12月至2019年6月，宁德市闽东医院病理科石蜡包埋块，HCC及邻近非肿瘤标本30例。所有标本均经免疫组织化学验证，并按原发灶(tumor，T)，淋巴结(node，N)，远处转移(metastasis，M)分期进行特征分析。本研究经宁德市闽东医院伦理委员会批准(批准号20170111)，肝癌临床标本石蜡块的使用告知患者，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：所有的细胞在37 ℃、5% CO2的DMEM高糖培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，将细胞分为：HepG2细胞对照组(Ctrl)、慢病毒空质粒组(NC)，慢病毒miR-203a-3p过表达组(OP)，TGF-β1处理组(TGF-β1)，TGF-β1联合miR-203a-3p过表达处理组(OP+TGF-β1)。

1.2.2 慢病毒感染与稳定细胞株的筛选：取出-80 ℃保存的病毒，放在冰上慢慢融化。病毒准备好之后，从培养箱中拿出已贴壁的细胞，各孔更换新鲜完全培养基后，向各组细胞中加入计算好的病毒液，HepG2细胞的感染复数(multiplicity of infection， MOI)值为30。摇动培养板，轻轻混匀，37 ℃、5% CO2培养24 h。弃去含病毒液的培养基上清，更换为完全培养基。37 ℃、5% CO2条件下继续培养。以嘌呤霉素(6 μg/mL)完成筛选，建立稳定表达miR-203a-3p的细胞株用于后续实验。

1.2.3 TGF-β1干预细胞模型：从培养箱中拿出已贴壁的细胞，更换新鲜完全培养基后，向各组细胞中加入含有TGF-β1(终浓度为10 mg/L，浓度的选择参考文献[5])的新鲜完全培养基，摇动培养板，轻轻混匀，37 ℃、5% CO2培养。每隔24 h弃去培养基，更换含TGF-β1的完全培养基，直至实验结束。

1.2.4 RT-qPCR检测miR-203a-3p及mRNA的表达：按照Norgen FFPE RNA提取试剂盒提取石蜡组织中的总RNA，按照RNAiso小RNA提取试剂说明书，提取细胞的小RNA。通过茎环引物对miR-203a-3p进行反转录，引物序列为:5′-CTCAACT GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTAGTG GT-3′。以U6(内参基因)的反转录作为下游引物。使用反转录酶说明书对分离的小RNA进行反转录。miR-203a-3p检测引物上游序列为5′-ACACTCCA GCTGGCGTGAAATGTTTAGG-3′，下游序列为常规序列5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。U6检测引物上游序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，使用第一链cDNA合成试剂盒完成mRNA的反转录。RT-PCR使用SYBR select master mix试剂盒进行。针对目的基因的引物(表1)。RT-qPCR在平行实验中，每个样本检测3次，GAPDH作为内对照。采用相对定量2-ΔΔCt法检测mRNA表达水平。

1.2.5 Western blot 检测TGF-β1蛋白的表达：用全细胞裂解法提取总蛋白质。用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。每个分组的总蛋白用12%的SDS-PAGE分离胶完成垂直电泳，然后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶进行封闭，清洗后采用鼠抗人TGF-β1(1∶2 000)、鼠抗人GAPDH(1∶5 000)单克隆抗体进行孵育，羊抗鼠二抗(1∶5 000)单克隆抗体进行孵育，以ECL发光试剂盒进行可视化发光成像。最后，使用化学发光检测系统完成成像和吸光度值分析。

1.2.6 ELISA检测TGF-β1的分泌情况：收集细胞培养上清，2 000 r/min离心5 min，取200 μL上清，以TGF-β1 ELISA 试剂盒，按照按说明书建立标准曲线，从而定量测定TGF-β1含量水平。

1.2.7 MTT法实验检测细胞增殖：用MTT细胞增殖试剂盒，按照说明书进行。细胞的增殖率以A450 nm的数值进行相互比较。

1.2.8 平板集落实验检测细胞集落形成：各组细胞接种到6孔板中，400个细胞/孔。将平板置于细胞培养接种器中培养1周至集落形成。用迪夫快速染色液固定细胞。最后对集落数量进行统计分析。集落形成率(%)=(细胞集落数/每孔细胞数)×100%。

1.2.9 划痕实验检测细胞迁移：各组细胞在对数增殖期转移到12孔培养板。12 h后将细胞贴壁，用200 μL移液管尖在培养孔中线进行划痕处理。分别于12 h和48 h用光学显微镜进行成像。观察两侧细胞的增殖和迁移情况，以划痕宽度作为检测值，评估偏移率。

1.2.10 流式细胞测量术检测细胞凋亡：取对数期细胞接种于6孔培养板，每孔以1×106个贴壁。然后每孔加入3 mL培养液，待底部区域细胞增殖达到90%汇合时进行实验。使用凋亡检测试剂盒，按照说明书在流式细胞仪中完成实验。

1.2.11 表达谱芯片检测差异mRNA的表达：人源表达谱芯片检测由上海康成生物技术有限公司完成，合计6份样本，包括3份HepG2细胞及和3份miR-203a-3p过表达的HepG2细胞。使用NanoDrop ND-1000对每个样本的总RNA进行定量，Arraystar Flash RNA标记协议(Arraystar)扩增每个样本的总RNA并转录成荧光cRNA。将标记的cRNA杂交到安捷伦人基因组表达谱芯片阵列(4×44K)上。洗片，用芯片扫描仪GenePix 4000B对阵列进行扫描，Agilent Feature Extraction软件(version 11.0)对获取的阵列图像进行分析。采用R软件limma软件包进行分位数归一化和后续数据处理。通过火山图过滤，筛选出两组间差异有统计学意义的mRNA。通过Fold Change filtering识别两个样本间差异表达的mRNA。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-203a-3p在细胞和临床标本中的表达

miR-203a-3p在HCC中的表达水平低于癌旁组织(P<0.001)(图1A)。miR-203a-3p在TNM期HCC患者中的表达水平明显低于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.001)(图1B)。miR-203a-3p在HepG2细胞中表达水平最低 (图1C)，选择HepG2细胞进行后续的细胞实验。HepG2细胞感染miR-203a-3p慢病毒颗粒后，miR-203a-3p的表达显著高于对照组(P<0.001)(图1D)。

2.2 miR-203a-3p对HepG2细胞增殖、凋亡和迁移的影响

相比于对照组， OP组细胞在24、48、72和96 h时增殖均降低(P<0.05)(图2A)；OP组细胞的迁移能力降低(P<0.05)(图2B)；OP组集落形成能力降低(P<0.001)(图2C)；OP组细胞凋亡显著增加 (P<0.05)(图2D)。

2.3 miR-203a-3p过表达对HepG2细胞中TGF-β1及其TGFβR1表达的影响

相比于对照组，CD27等12个基因表达升高(P<0.05)，MMP7等7个基因表达降低(P<0.05) (图3A)，关注一对配体TGF-β1及其受体TGFβR1基因的表达；相比于Ctrl组，OP组TGF-β1 mRNA表达降低(P<0.05)，而转化生长因子β受体1(transforming growth factor beta receptor 1，TGFβR1)mRNA表达升高(P<0.05)(图3B)；OP组TGF-β1在细胞培养上清中含量明显降低(P<0.05)(图3C)；OP组TGF-β1表达降低(P<0.05)，而TGFβR1表达升高(P<0.05) (图3D,E)。

2.4 TGF-β1联合miR-203a-3p对HepG2细胞增殖和迁移的影响

相比于OP组， OP+TGF-β1组在48、 72和96 h时细胞增殖能力上升(P<0.05)(图4A)；OP+TGF-β1组48 h细胞迁移能力上升(P<0.05)(图4B,C)。

A.expression of miR-203a-3p in 30 patients with HCC was significantly lower than that in 30 cases of adjacent tissues; B.expression of miR-203a-3p was negatively correlated with histological grade; C.expression of miR-203a-3p was in expression in HCC cells (LO2, HepG2, Huh7, SMMC-7721 and Bel-7402); D.RT-qPCR verified miR-203a-3p over-expression; *P<0.05 compared with tumor, grade and Ctrl group

A.HepG2 cell proliferation test; B.HepG2 cell scratch test; C.HepG2 cell colony formation test; D.HepG2 cell apoptosis test; *P<0.05 compared with Ctrl group

3 讨论

研究表明，miR-203在HCC中表达下调，高表达miR-203是HCC手术后预后良好的独立预测因子[6]。在本研究中，收集临床HCC的癌及癌旁的成对标本，分析miR-203a-3p在癌及癌旁肿瘤中的表达模式。结果显示miR-203a-3p在HCC中低表达，且与HCC的进展和分期呈负相关，这与报道的结果一致。然而miR-203 的表达也被描述为在几种癌中上调，例如结肠癌[7]和胰腺癌[8]。miR-203 在癌发展中的这些相互矛盾的结果可能是由于 miRNA表达的特定特征，其根据癌类型而变化。

miR-203在多个癌中发挥抑制功能。研究显示miR-203的模拟物可以抑制食道癌细胞增殖和侵袭能力[9]。miR-203可以抑制前列腺癌细胞增殖和迁移[10]，其过表达促进前列腺癌细胞凋亡[11]。miR-203 还可抑制乳腺癌细胞的活力、迁移和侵袭[12]。在HCC中，已有研究表明miR-203 在体外抑制 HCC 细胞的迁移、侵袭和增殖[13]。本文以miR-203a-3p过表达HepG2细胞作为研究模型，证实miR-203a-3p降低增殖能力和迁移能力，促进凋亡效应和削弱集落形成能力，这与报道一致，充分证实 miR-203a-3p在HCC中发挥类似抑癌基因的功能。

一般来说，miR-203在转录后调控基因表达，并对信号分子发生反应，从而发挥影响癌细胞表现变化的功能。本研究通过表达谱芯片发现TGF-β信号通路相关的TGF-β1及其TGFβR1基因表达差异较大。TGF-β1是肿瘤微环境(tumor microenviron-ment，TME)内多种细胞产生的，负责调控肿瘤微环境内的细胞活性。免疫组化检测显示，TGF-β1蛋白在肝癌组织中的表达明显高于腹膜肝组织， TGF-β1mRNA表达的表达水平亦明显低于腹膜肝组织[14]。有趣的是，本文发现细胞内TGF-β1蛋白表达降低，细胞外培养上清中TGF-β1蛋白含量降低这说明miR-203a-3p可以降低HepG2细胞中TGF-β1蛋白的表达。TGFBR1是TGF-β1的受体膜基因，TGF-β1驱动细胞后，TGFBR1介导SMAD2/3复合物磷酸化，影响下游通路。TGFBR1表达的增加可能是细胞的代偿作用，因为TGF-β1蛋白在细胞外的刺激减弱，细胞的代偿作用增加了TGF-β信号通路的能力。TGF-β信号通路在肝癌中又发挥着促癌机制[15]。本研究采用TGF-β1重组蛋白进行细胞培养的外在刺激，使得miR-203a-3p过表达的HepG2细胞部分恢复了细胞增殖和迁移能力。

A.heat map, red-labeled was over-expressed, green-labeled was down-regulated; B.RT-qPCR verified the expression of TGF-β1 and TGFβR1 mRNA; C.ELISA to detect TGF-β1 protein content in cell culture supernatant; D, E.Western blot to detect TGF-β1 and TGFβR1 protein expression level in cells; *P<0.05 compared with ctrl group

综上所述，miR-203a-3p在HCC中低表达，过表达miR-203a-3p可降低HepG2细胞增殖、集落形成，促进细胞凋亡，miR-203a-3p可以降低TGF-β1基因的表达水平，但是生物信息预测显示miR-203a-3p与TGF-β1 mRNA之间无靶向相关性，说明其抑制表达是间接作用。总之，miR-203a-3p是否通过TGF-β途径发挥抑癌功能的作用机制还要进一步探索。