间充质干细胞移植治疗肝脏疾病的研究进展

周嘉航，陈鋆瑶，曹红翠

浙江大学医学院附属第一医院 传染病诊治国家重点实验室 国家感染性疾病临床医学研究中心 感染性疾病诊治协同创新中心，浙江 杭州 310003

病毒、酗酒、药物、代谢紊乱和自身免疫攻击均可引发急性、慢性肝损伤，从而导致肝衰竭和肝硬化，对人类健康构成重大威胁。原位肝移植是治疗肝硬化和肝衰竭确切有效的治疗方法。然而， 合适的供体器官数量非常有限，迫切需要为肝硬化和肝衰竭患者寻找更有效和可行的治疗方法。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其易获得性、体外培养的稳定性、低免疫原性和多向分化潜能等众多优势在多种细胞治疗中被认为是肝脏疾病最有希望的候选疗法。MSCs还可以分泌可溶性因子等物质，有利于损伤肝脏的再生和修复。本文拟对MSCs在肝脏疾病的临床应用以及在肝脏疾病的动物模型中的作用机制进行综述。

1 间充质干细胞的来源与特性

MSCs是一种来源于中胚层的多能干细胞，可在体外增殖为具有可塑性的贴壁细胞。国际细胞治疗学会(International Society for Cellular Therapy, ISCT)间充质和组织干细胞委员会给出人源MSCs最低定义标准：镜下呈成纤维细胞样，在体外可形成集落，并可分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，高表达CD105、CD73和CD90，不表达或低表达CD45、CD34、CD14或CD11、CD79a或CD19和HLA-DR等表面分子[1]。

MSCs于1995年首次作为细胞药物在人类受试者中进行临床验证[2]，此后成为全球临床研究最活跃的实验性治疗细胞。在临床试验中，MSCs已被用于治疗各种组织损伤和免疫相关疾病。对于肝脏疾病，组织损伤的发生和炎性反应的过度激活总是如影随形。因此，MSCs将是肝脏疾病细胞治疗的最佳候选者。

2 间充质干细胞治疗肝脏疾病的临床研究

MSCs已被证明在肝脏疾病的临床治疗中发挥有益作用，包括改善肝硬化及其发展而来的慢加急性肝衰竭和慢性肝衰竭，以及减轻肝移植术后的免疫排斥。

2.1 肝硬化

肝硬化是因病毒感染、酒精、药物等一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝纤维化病变。代偿期可无明显症状，失代偿期(即肝衰竭)以肝功能损害和门脉高压为主要表现。肝衰竭是一种以肝细胞大量坏死为特征的严重的临床综合征。在中国，以肝硬化发展而来的慢加急性(亚急性)肝衰竭和慢性肝衰竭为主，其中乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染相关肝衰竭比例最高。

2.1.1 乙型肝炎病毒相关性肝硬化

2.1.1.1 慢加急性肝衰竭:一些慢性乙型肝炎患者可能会迅速发展为慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)，这是一种严重的、危及生命的疾病[3]。脐带和骨髓等多种来源的MSCs被用于临床治疗ACLF研究。

一项2012年发表的研究评估了脐带来源的间充质干细胞(umbilical cord-derived MSCs, UC-MSCs)输注对HBV相关性ACLF(HBV-ACLF)患者的安全性和初步疗效。共有43例ACLF患者参加了这项研究，其中24例患者接受了UC-MSCs 治疗，19例患者接受了0.9%氯化钠溶液作为对照。试验期间未观察到明显的不良反应，输注UC-MSCs显著提高了ACLF患者的存活率，降低了终末期肝病模型 (model for end-stage liver disease, MELD)评分，增加了血清白蛋白(albumin, ALB)、胆碱酯酶、凝血酶原活性和血小板数，并且显著降低了血清总胆红素(total bilirubin, TBIL)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)。这项研究证明UC-MSCs输注在临床上是安全的，可作为HBV-ACLF患者的一种新的治疗方法[4]。

骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs, BM-MSCs)也被用于临床治疗HBV-ACLF。一项研究纳入110例患者，其中54例对照组患者仅接受标准药物治疗，56例实验组患者每周输注异体BM-MSCs，证实了外周输注异体BM-MSCs对HBV-ACLF患者安全、方便，并且可通过改善肝功能、降低严重感染发生率从而显著提高24周生存率[5]。

由此可见，临床上使用MSCs治疗HBV-ACLF是安全的，但由于ACLF发病和进展都十分迅速，使得用MSCs治疗此病的临床研究开展不够广泛。因此，还需要更多的临床研究来证实MSCs的使用对ACLF患者生存率的提高。

2.1.1.2 慢性肝衰竭:慢性肝衰竭(chronic liver failure, CLF)是在肝硬化基础上肝功能进行性减退导致的以腹水、门静脉高压、凝血功能障碍和肝性脑病等为主要表现的慢性肝功能失代偿性疾病[6]。目前临床上已开展了许多关于MSCs治疗CLF的研究。因其进展缓慢，除了异体MSCs输注外，有足够的时间可取患者自体骨髓或脂肪来源的MSCs进行体外培养并回输治疗。

迄今HBV-CLF仍是临床治疗的难点。在一项自体BM-MSCs治疗乙肝肝衰竭的研究中，53例患者接受经肝固有动脉单次移植自体BM-MSCs移植的成功率为100%，未出现严重的不良反应或并发症；移植后2～3周，移植组患者ALB、TBIL及MELD评分较对照组明显改善。然而，在192周的随访中，两组的肝细胞癌发病率或死亡率没有显著差异。上述结果提示MSCs移植治疗肝脏疾病至少短期疗效是显著的[7]。

另一项类似的研究纳入39例患者(移植组20例，对照组19例)，发现自体BM-MSCs经肝动脉移植入肝脏中可以改善患者的肝功能。此外，与对照组相比，移植组调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)显著增加，辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)显著减少，导致Treg/Th17比值增加。这提示BM-MSCs产生修复作用的机制与调节Treg/Th17细胞平衡有关[8]。

然而，Mohamadnejad等进行的临床随机对照试验表明，经外周静脉的自体BM-MSCs移植可能对肝硬化患者无益处。此研究共纳入27例患者(移植组15例，安慰剂组12例)，在12个月的随访中，移植组和安慰剂组的Child评分、MELD评分、ALB、国际标准化比值(INR)、血清转氨酶和肝体积的绝对变化没有显著差异。基于该随机对照试验，有必要对更多患者进行进一步研究，以更好地阐明通过外周静脉或门静脉输注MSCs对肝硬化的影响[9]。

除自体来源的BM-MSCs外，同种异体UC-MSCs也被用于临床治疗HBV-CLF。3项临床研究[10-12]均证实将UC-MSCs经外周静脉输注到CLF体内，可以显著提高患者的长期生存率和肝功能，如提高血清ALB和降低血清TBIL水平，并且未观察到明显的不良反应和并发症。以上提示UC-MSCs或许是治疗CLF的合适选择。

2.1.2 丙型肝炎病毒相关性肝硬化:目前临床研究多用自体来源的BM-MSCs治疗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)相关肝硬化。Amer等纳入20例终末期肝衰竭患者进行BM-MSCs经肝或脾脏内注射移植，结果显示移植组腹水、下肢浮肿、低蛋白血症等均较对照组有显著改善，Child评分、MELD评分均有降低；并且肝内组和脾内组之间没有观察到差异。这一结果证明了自体BM-MSCs注射液治疗肝硬化的安全性和短期疗效[13]。

另一项针对20例慢性HCV引起的肝纤维化患者的临床试验中，通过脾动脉注射自体BM-MSCs，临床随访24周，结果显示患者肝功能显著提高，起到了逆转肝纤维化进程的目的[14]。

两项通过静脉输注BM-MSCs来治疗肝硬化的临床研究同样证实了外周静脉输注与之前报道的肝内输注同样有效[15-16]。并且，在粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)动员后静脉输注BM-MSCs可在前2周内改善血清ALB，并在1个月后改善凝血酶原浓度和ALT。这些结果提示联合使用细胞因子可以提高BM-MSCs的疗效[16]。

2.1.3 酒精性肝硬化:一项试点研究关注自体BM-MSCs对酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis, AC)疗效[17]，纳入了12例患者，通过肝动脉注射两次BM-MSCs，观察到治疗后组织学改善和纤维化指标的降低。

此课题组在后续的研究中纳入更多的AC患者(72例)，并设置对照组、一次及两次经肝动脉注射细胞组，证实了自体BM-MSCs移植可安全改善AC患者的组织学纤维化和肝功能，以及一次和两次注射组的治疗效果并无明显差异[18]。这些结果显示自体BM-MSCs移植对AC患者有较好的疗效。

2.1.4 自身免疫性肝硬化:熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是一种治疗原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)患者有效的药物；然而，40% PBC患者对UDCA治疗的反应不佳。已有临床研究证实同种异体的BM-MSCs[19]和UC-MSCs[20]经外周静脉输注到对UDCA反应不完全的PBC患者体内，没有观察到移植相关的不良反应；并且细胞治疗后大部分患者的乏力、瘙痒等症状明显减轻，肝功能明显改善。

近年来，Liang等进行的临床试验纳入26例自身免疫性疾病(包括PBC、原发性干燥综合征、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症)所致肝硬化的患者，通过外周静脉输注MSCs进行治疗，其中23例患者接受了UC-MSCs，2例患者接受了脐带血来源的间充质干细胞(umbilical cord blood-derived MSCs, UCB-MSCs)，1例患者接受了BM-MSCs。随访半年，肝功能和MELD评分均有所改善[21]。

从以上结果看，无疑需要纳入更多的临床病例以及设置对照组来支持这一结果。

2.1.5 综合比较:同种异体BM-MSCs被用于4例病因各异(HBV/HCV/非酒精性/酒精性)的ACLF患者，未表现出输注相关的不良反应，且未观察到存活率的显著提高，但Child评分和MELD评分显著改善[22]。

Sakai等[25]用新鲜分离的自体AD-MSCs对4例肝硬化患者(HBV/HCV/非酒精性)进行了治疗，随访一年，并未观察到严重的不良事件，并且患者肝功能有所恢复。这项临床研究证明自体AD-MSCs用于治疗肝硬化是安全的。

然而目前纳入各种病因所致肝硬化的临床研究多缺乏对照组，并且缺乏对MSCs治疗不同病因所致肝硬化的疗效的差异研究。

2.2 肝移植术后并发症

肝移植是目前治疗终末期肝病的唯一有效手段。然而，肝移植术后的并发症如胆道并发症、急性排斥反应和感染等会影响移植效果，严重威胁移植受者的生存。迫切需要一种新颖有效的治疗策略。由于免疫抑制和再生的特性，MSCs可能是一个有效的治疗方法。

Zhang等[26]将同种异体UC-MSCs通过外周静脉多次输注到12例肝移植后缺血型胆道病变患者体内，与对照组相比，细胞治疗组未观察到明显的MSCs相关不良事件，并且治疗组的肝功能和短期存活率都有所提高。此课题组后续将UC-MSCs通过静脉输注到11例ABO血型不合肝移植((ABO-incompatible liver transplantation, ABO-iLT)受者体内，评估在ABO-iLT中使用MSCs替代利妥昔单抗的安全性和可行性[27]。在为期两年的随访期间，未观察到严重的MSCs相关不良事件；在降低急性排斥发生率方面，MSCs治疗产生了与利妥昔单抗相当、甚至更好的结果；MSCs组的胆道并发症和感染率显著降低。但是，两组患者2年存活率无显著差异。这两项研究提示了MSCs的短期疗效。

与之类似，Shi等[28]也评估了同种异体UC-MSCs对治疗急性移植物排斥反应的肝移植患者的安全性和临床可行性。此研究发现在经静脉给予UC-MSCs后4周，Tregs百分比和 Treg/Th17 比率显著增加；相比之下，Th17百分比呈下降趋势；表明MSCs可能通过对T细胞亚群的免疫抑制来发挥治疗作用。

除UC-MSCs外，BM-MSCs也在临床试验中被用于治疗肝移植患者。在一项临床试验中[29]，20例肝移植患者被1∶1随机分配为细胞治疗组和对照组。细胞治疗组在移植前经静脉接受单次同种异体BM-MSCs移植。随访一年，细胞治疗的患者均未出现输注相关并发症；与对照组相比，细胞治疗组循环Treg细胞和耐受性NK细胞亚群在CD56brightNK细胞中的比例比基线略有增加，但移植物功能和存活率并未明显提高。类似地，Detry等[30]也将同种异体BM-MSCs经静脉单次输注在10例肝移植患者体内并随访一年，MSCs输注后并未出现器官功能的损害，但是总体排斥率或移植物存活率没有差异。

综上，肝移植受者的移植前或后同种异体BM-MSCs输注是安全的，但对促进耐受和提高存活率方面并未表现出明显效果。在抑制肝移植后并发症方面，目前临床实验结果显示UC-MSCs优于BM-MSCs，前者的使用剂量大大高于后者可能是原因之一。未来还需要更多的控制变量的临床试验来得出更可靠的结论。

3 间充质干细胞治疗肝脏疾病的机制

MSCs除了可直接分化为肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells，HLCs)外，更重要的是在受损肝脏中分泌各种可溶性因子来达到抗氧化、抗调节性细胞死亡、抗纤维化、抑制炎性反应、抑制免疫反应等作用。

3.1 分化为肝细胞样细胞

MSCs对3个胚层的细胞都有分化潜能。大多数体外研究表明，MSCs能够在特定生长因子，如肝细胞生长因子、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子和制瘤素M的作用下分化成具有肝脏特异性形态和功能的HLCs[31-34]。最近，Zhao等[35]通过非病毒的4个步骤将AD-MSCs有效地诱导成HLCs，使其成功地表达肝细胞标志物、药物代谢酶和转运蛋白；并在后续的研究[36]中阐明AD-MSCs向特定的内胚层分化的调控机制，有助于开发新的策略来提高MSCs的分化效率。

此外，一些动物实验也证实了MSCs在体内可以分化为HLCs。Sato等[37]首次证明了MSCs的体内肝分化。在该研究中，将人BM-MSCs直接移植到烯丙醇处理的大鼠肝脏中，第28天观察到人BM-MSCs分化而来的HLCs，其表达人特异性标志物如甲胎蛋白、ALB、细胞角蛋白18 (cytokeratin 18, CK18)、CK19和去唾液酸糖蛋白受体。Cao等[38]证明了人胎盘来源的间充质干细胞(placenta-derived MSCs, PMSCs)不仅可以在体外和体内分化成HLCs，而且可以延长D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-Gal)诱导的ALF中国小型猪的存活时间。

除了骨髓和胎盘，脂肪组织[39]、脐带[40]等来源的MSCs也可以向肝细胞分化。这些研究结果均表明MSCs可以在体内分化为HLCs。然而，只有一小部分MSCs(不到肝脏总质量的3%)经历了肝细胞转分化[41]。MSCs衍生的HLCs发挥作用不仅需要表达成熟肝细胞的基因，而且表达水平需要达到或接近正常肝细胞；而实际上分化的MSCs中缺乏一些肝细胞标志物，如HepPar1(hepatocyte paraffin 1)或肝细胞核因子4，这意味着它们的分化没有达到成熟肝细胞的水平[40]。总的来说，MSCs介导的治疗效果很可能更依赖于其他机制，MSCs直接分化为HLCs这一机制只占极其有限的部分。

3.2 抗氧化

氧化应激是导致肝脏损伤的一个关键因素，其中活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是公认的有害分子。与MSCs共培养的肝细胞内ROS减少；硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)诱导的肝损伤小鼠经MSCs治疗后表现出改善的氧化参数[42]。类似地，在治疗四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导的肝损伤小鼠中，MSCs显著增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性并抑制受损肝脏中ROS的产生[43]。这些均证实了MSCs可通过抗氧化活性和保肝作用减少肝损伤，显示出治疗肝脏疾病的潜力。

3.3 抗调节性细胞死亡

在损伤肝脏中，肝细胞已被证明可能以多种形式发生调节性细胞死亡，如凋亡和铁死亡等，以应对氧化应激等压力[44]。

在D-Gal诱导的暴发性肝衰竭大鼠模型中，通过输注MSCs条件培养基(MSCs-conditioned medium,MSCs-CM)使凋亡性肝细胞死亡减少了90%，增殖肝细胞数量增加了3倍。提示MSCs-CM可通过抑制肝细胞死亡和刺激再生为受伤的肝脏提供营养支持[45]。

最近，肝细胞铁死亡被证明是CCl4诱导的小鼠急性肝损伤中的重要机制。小鼠BM-MSCs及其来源的外泌体治疗可下调小鼠肝脏中前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)和脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)的mRNA水平，同时恢复溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7, member 11, SLC7A11)的蛋白水平，从而抑制肝细胞铁死亡，减轻小鼠急性肝损伤[46]。

以上结果表明MSCs具有的抗凋亡和抗铁死亡等功能可为ALF的治疗提供新的途径。

3.4 抗纤维化

当肝脏受损时，静止的肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)转分化为活化的HSCs，这是肝纤维化形成的主要环节。MSCs可分泌各种细胞因子抑制HSCs活化，从而预防或减少肝纤维化。乳脂球-EGF因子8(milk fat globule EGF factor 8，MFGE8)是MSCs分泌的一种抗纤维化蛋白，可与HSCs上的avb3整合素结合来下调转化生长因子-β(transform-ing growth factor-β, TGF-β) 1型受体的表达，从而抑制TGF-β信号传导并减少小鼠细胞外基质沉积和肝纤维化[47]。此外，MSCs释放肿瘤坏死因子α刺激基因-6(tumor necrosis factor α stimulated gene 6, TSG-6)，可显著下调HSCs活化标志物，诱导HSCs转化为干细胞样细胞；经 TSG-6处理的HSCs类器官可以修复肝纤维化，表明TSG-6直接重编程HSCs可能是肝纤维化的有用策略[48]。Wang等[49]的进一步研究证实了TSG-6的重要性，并拓展其通过调节M2型巨噬细胞和增加基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)12表达的抗纤维化机制。MSCs还可通过吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)降低肝脏中Th17细胞数量以及血清IL-17水平，从而减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化[50]。

3.5 抑制炎性反应

MSCs可以通过分泌多种生物活性因子来调节组织免疫反应，从而抑制炎性反应，改善或修复受损肝组织。有研究证明MSCs中白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL1Ra)的表达有助于促进巨噬细胞向M2表型转换，从而提高血清IL-10水平，减少刀豆蛋白 A (concanavalin A, Con A)诱导的小鼠肝损伤[51]。

MSCs还被证明可通过前列腺素E2(prostag-landin E2，PGE2)的分泌抑制肝巨噬细胞中的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎性小体活化，诱导其为抑炎巨噬细胞 (M2)，从而减少炎性细胞因子的产生；此机制不仅在修复小鼠肝脏缺血/再灌注损伤中起着关键作用[52]，并且在减轻D-Gal/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠急性肝损伤中扮演重要角色[53]。除此之外，MSCs还可通过抑制促炎单核细胞的募集、促进其向抑炎巨噬细胞的分化等来维持肝脏巨噬细胞稳态，从而减轻CCl4诱导的小鼠急性肝损伤中的炎性反应，提高存活率[54]。

3.6 抑制免疫反应

T细胞是导致肝移植后产生免疫排斥的关键细胞，已有大量体外实验证明MSCs能够通过产生可溶性因子而对T细胞产生抑制作用。干扰素γ(interferon γ, IFN-γ)诱导MSCs产生的IDO能催化色氨酸向犬尿氨酸转化。体外研究证明MSCs高表达的IDO不仅能够在混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte response, MLR)中抑制同种异体T细胞反应[55]，并且能够通过诱导活化的T细胞凋亡来抑制T细胞增殖[56]，从多个方面对T细胞产生抑制作用。

此外，MSCs产生的一氧化氮(nitric oxide, NO)也是抑制T细胞的主要介质之一。有研究证明在MSCs存在下，NO参与Stat5磷酸化和T细胞增殖的抑制[57]。进一步的研究发现，NO与趋化因子的协同作用还可诱导MSCs对T细胞的反应性产生抑制作用，有助于预防小鼠移植物抗宿主病[58]。

虽然目前缺乏在肝移植动物模型中对上述机制进行的实验验证，但是这些结果为MSCs诱导的免疫抑制机制带来了新的见解，并可能有助于开发其临床应用，以控制人类肝移植免疫相关的不良反应。

基于上述研究，MSCs被认为主要以两种方式表现出积极的治疗效果：直接通过细胞分化和间接通过旁分泌效应。对于肝脏疾病的治疗，MSCs的旁分泌作用可能起着更重要的作用。然而上述治疗机制不一定同时出现在治疗同一疾病的过程中。根据不同肝脏疾病的基本特征，MSCs在治疗过程中的作用机制表现有所侧重。例如，MSCs治疗肝功能衰竭的疗效可能主要取决于其分化成肝细胞样细胞的特性；而在治疗与炎性反应相关的肝病如急性肝损伤时，MSCs的抗炎、抗氧化和抑制凋亡的功能可能起到更重要的作用；对于肝纤维化，MSCs对活化HSCs命运的影响则更多地体现在参与治疗过程；在治疗与免疫相关的肝病如肝移植并发症时，MSCs的免疫调节功能可能起到更重要的作用。

4 问题与展望

在治疗HBV、HCV或酒精等病因引起的肝硬化、肝衰竭以及肝移植引起的并发症等肝病患者的临床试验中，MSCs被证实是一种安全且有前景的治疗策略。然而，MSCs是一类典型的异质性细胞群体，在其治疗的应用中仍然存在一些尚未解决的重要问题。首先，缺乏统一的标准来评估每个试验中MSCs的质量，包括体外长期培养细胞的稳定性，需要建立完善的MSCs质量标准评价体系。其次，缺乏对MSCs治疗最佳注射时机、次数、间隔时间、最佳细胞来源、最少有效细胞数量以及最佳给药途径的相关研究，需要平衡相应的治疗效果以及获得相应剂量MSCs所需的时间和经济成本来确定最佳的治疗方案。最后也是最关键的一点是，目前对MSCs产生治疗作用的机制了解得不够深入；例如，MSCs在何种环境下会被激活，通过分泌何种细胞因子达到抗炎、抗氧化、抑制纤维化等效果，哪些信号通路参与其中，不同来源的MSCs发挥治疗作用的机制有什么差别等问题，均未得到清晰而全面的阐明。总之，随着上述问题的解决，MSCs移植作为一种极具潜力的肝病治疗方式有望得到更广泛的临床应用。