丙泊酚减轻低氧诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12炎性反应和细胞凋亡

顾 炜，祝剑平，吴品雯

复旦大学附属闵行医院 麻醉科，上海 201199

缺氧会引起脑神经细胞损伤，导致能量剥夺和功能障碍，伴随神经元凋亡[1]。丙泊酚(propofol)是一种高脂溶性麻醉药，广泛用于接受手术或重症监护的患者的麻醉和镇静。既往研究表明，丙泊酚具有抗氧化、抗炎等特性，可以改善缺血低氧/再灌注诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12的损伤[2]，此外，丙泊酚通过上调微小RNA(microRNA，miRNA/miR)-153，减轻低氧诱导的PC12细胞的神经凋亡[3]。然而丙泊酚对低氧诱导PC12细胞氧化应激、炎性反应的影响即调控机制仍未完全阐明。MiRNA指长度为19～24个核苷酸的内源性非编码RNA。在所有这些已鉴定的miRNA中，miR-141-3p被证明在缺血性卒中隔离后显著增加，抗miR-141-3p可能用于卒中治疗[4]。miR-141-3p在帕金森病体外细胞模型中诱导PC12细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能障碍[5]。此外，miR-141-3p的下调是淫羊藿次苷Ⅱ改善局灶性脑缺血大鼠神经功能的重要途径之一[6]。但miR-141-3p是否参与丙泊酚影响低氧处理的PC12细胞的过程仍未可知。本研究旨在考察丙泊酚对低氧诱导的PC12细胞凋亡、氧化应激和炎性反应的影响，并通过miR-141-3p探讨丙泊酚的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12(pheochromocytoma cell line， PC12)胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；丙泊酚(Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen公司)；抗miR-141-3p(anti-miR-141-3p)、对照anti-miR-con、miR-141-3p模拟物和模拟物对照miR-con(Ribobio公司)；细胞凋亡检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase，SOD)检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime公司)；抗活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase-3)抗体(Abcam公司)；PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa公司)；SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组和处理：PC12细胞维持在10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中增殖。PC12细胞置于94% N2、5% CO2和1% O2的培养箱中保持48 h。

将PC12细胞分为对照组、低氧组(刺激PC12细胞48 h)、(5、10、20 μmol/L)丙泊酚(刺激PC12细胞48 h)+低氧组、anti-miR-con+低氧组、anti-miR-141-3p+低氧组、miR-con+20 μmol/L 丙泊酚+低氧组、miR-141-3p+20 μmol/L 丙泊酚+低氧组。其中常氧培养的PC12细胞为对照组，低氧培养的PC12细胞为低氧组，5、10、20 μmol/L丙泊酚给药后于低氧条件下孵育，为5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧组。利用Lipofectamine 3000试剂在PC12细胞中转染anti-miR-con、anti-miR-141-3p并进行低氧培养，为anti-miR-con+低氧组、anti-miR-141-3p+低氧组。PC12细胞中转染miR-con、miR-141-3p模拟物，并进行20 μmol/L丙泊酚和低氧培养，为(miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧)组、(miR-141-3p+20 μmol/L丙泊酚+低氧)组。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡：收获PC12细胞(5×105个)，用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，然后用结合缓冲液悬浮。按照细胞凋亡试剂盒操作指示，用膜联蛋白Ⅴ(annexin Ⅴ)-FITC和碘化丙啶(propid-ium iodide，PI)溶液处理细胞。使用Becton Dickinson FACScan流式细胞仪进行凋亡数据分析。

1.2.3 Western blot检测cleaved caspase-3蛋白的表达：使用RIPA裂解缓冲液从PC12细胞中提取蛋白质，蛋白浓度用BCA蛋白质测定试剂盒测定。蛋白质通过12% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。在5%脱脂牛奶中封闭后，将膜与一抗cleaved caspase-3、内参β-肌动蛋白(β-actin)(4 ℃，过夜)和由辣根过氧化物酶标记的二抗(室温，1 h)按序孵育。通过增强化学发光方法捕获信号，并使用Image Lab软件进行cleaved caspase-3定量条带强度分析。

1.2.4 试剂盒检测MDA含量、SOD活性：收获PC12细胞上清液，分别使用检测试剂盒测定MDA含量和SOD活性。

1.2.5 活性氧荧光探针DCFH-DA法测定ROS含量：将PC12细胞(1×105个细胞/mL)接种在6孔板中。进行不同处理后，用磷酸盐缓冲液洗涤PC12细胞，然后在含有10 μmol/L DCFH-DA的培养基中，37 ℃避光培养30 min。用Becton Dickinson FACScan流式细胞仪进行分析，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

1.2.6 ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6含量：收获PC12细胞上清液，根据试剂盒操作步骤，使用ELISA测定TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.2.7 RT-qPCR检测miR-141-3p表达：使用TRIzol从PC12细胞中提取总RNA。使用Prime Script RT Master Mix进行miR-141-3p的cDNA合成。使用SYBR Green Master Mix在ABI 7500仪器上进行基因扩增。miR-141-3p的计算按照2-△△Ct法进行。引物序列如下：miR-141-3p F 5′-CGGGCTAACACTGTCTG GTAAAG-3′，miR-141-3p R 5′-GTGCAGGGTCCGAGG TATTC-3′，内参U6F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6R 5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度丙泊酚对低氧处理的PC12细胞凋亡的影响

与对照组比较，低氧组PC12细胞的凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表达水平均升高；与低氧组比较，5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧组PC12细胞的凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表达水平均随丙泊酚浓度的增加呈降低趋势(P<0.05)(表1，图1)。

2.2 丙泊酚对低氧处理的PC12细胞氧化应激和炎性反应的影响

与对照组比较，低氧组PC12细胞的MDA含量增加，SOD活性减弱，ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均升高；与低氧组比较，5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧组PC12细胞的MDA含量随丙泊酚浓度的增加呈降低趋势，SOD活性随丙泊酚浓度的增加呈升高趋势，ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均随丙泊酚浓度的增加呈降低趋势(P<0.05)(表2)。

表1 不同浓度丙泊酚对低氧处理的PC12细胞凋亡的影响

2.3 丙泊酚对miR-141-3p表达的影响

与对照组比较，低氧组PC12细胞的miR-141-3p表达量升高；与低氧组比较，5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧组PC12细胞的miR-141-3p表达量随丙泊酚浓度的增加呈降低趋势(P<0.05)(表3)。

2.4 Anti-miR-141-3p对低氧处理的PC12细胞凋亡，氧化应激和炎性反应的影响

Anti-miR-141-3p+低氧组PC12细胞的miR-141-3p表达量、cleaved caspase-3蛋白表达水平、MDA含量均比anti-miR-con+低氧组降低，SOD活性比anti-miR-con+低氧组增加，ROS、 TNF-α、 IL-1β、 IL-6含量和细胞凋亡率均比anti-miR-con+低氧组减少(P<0.05)(表4，图2)。

A.flow cytometry to detect apoptosis; B.western blot detection of cleaved caspase-3 protein expression图1 不同浓度丙泊酚对低氧处理的PC12细胞凋亡的影响Fig 1 Effect of different concentrations of propofol on the apoptosis of PC12 cells treated with hypoxia

表2 丙泊酚对低氧处理的PC12细胞中MDA、SOD、ROS活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响

表3 丙泊酚对miR-141-3p表达的影响

2.5 miR-141-3p逆转丙泊酚对低氧处理的PC12凋亡，氧化应激和炎性反应的影响

miR-141-3p+20 μmol/L 丙泊酚+低氧组PC12细胞的miR-141-3p表达量、cleaved caspase-3蛋白表达水平、MDA含量均高于miR-con+20 μmol/L 丙泊酚+低氧组，SOD活性低于miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧组，ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和细胞凋亡率均高于miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧组(P<0.05)(表5，图3)。

A.flow cytometry to detect apoptosis; B.western blot to detect the expression of cleaved caspase-3 protein图2 Anti-miR-141-3p对低氧处理的PC12细胞凋亡的影响Fig 2 Effect of anti-miR-141-3p on the apoptosis of hypoxia-treated PC12 cells

表4 Anti-miR-141-3p对低氧处理的PC12细胞凋亡、氧化应激和炎性反应的影响

表5 miR-141-3p可以逆转丙泊酚对低氧处理的PC12细胞凋亡、氧化应激和炎性反应的影响

A.flow cytometry to detect apoptosis; B.Western blot to detect the expression of cleaved caspase-3 protein图3 miR-141-3p可以逆转丙泊酚对低氧处理的PC12细胞凋亡的影响Fig 3 miR-141-3p could reverse the effects of propofol on hypoxia-treated PC12 cells apoptosis

3 讨论

细胞凋亡与低氧引起的损伤密切相关，本研究发现低氧可促进PC12细胞凋亡，但5、10、20 μmol/L丙泊酚降低低氧诱导的细胞凋亡、cleaved caspase-3蛋白表达，提示丙泊酚保护PC12细胞免受低氧诱导的损伤。在肾缺血/再灌注损伤的小鼠模型中，丙泊酚可以减少细胞凋亡和cleaved caspase-3表达[7]。丙泊酚通过MALAT1/miR-182-5p/TLR4轴减少低氧/复氧的PC12细胞的凋亡[8]。

已经证明氧化应激在低氧诱导的损伤中起着至关重要的作用[9]。有报道，低氧可增加PC12细胞的ROS、MDA，但SOD和过氧化氢酶(catalase，CAT)水平降低[10]。本研究结果与之前报告的结果一致，即低氧会导致PC12细胞发生氧化应激。丙泊酚治疗减轻缺血/再灌注导致的肠、肺形态学改变，并降低MDA水平和caspase-3表达，使SOD活性升高[11]。本研究中，5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制细胞中ROS产生，降低MDA水平，并恢复抗氧化酶SOD活性，表明丙泊酚可改善低氧引起的PC12细胞氧化应激。

炎性反应是低氧诱导损伤的另一重要促成因素，在脑缺血大鼠神经损伤中，丙泊酚减轻大鼠神经元病理损伤，并降低IL-6及TNF-α水平[12]。本研究中，5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制低氧诱导后PC12细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，表明丙泊酚可以改善低氧引起的PC12细胞炎性反应。

本研究中，低氧诱导PC12细胞中miR-141-3p表达的增加，而5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制miR-141-3p表达，因此推测丙泊酚调节低氧后的PC细胞功能可能与抑制miR-141-3p表达有关。在神经退行性疾病中，PC12细胞经1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-pyridinium，MPP+)后，miR-141-3p上调[13]。miR-141-3p以时间依赖性方式在中风小鼠中上调，抑制miR-141-3p可改善死亡率、神经功能缺损并减少梗塞体积[14]。以上说明miR-141-3p参与神经损伤性疾病，但miR-141-3p在低氧诱导PC12细胞损伤中的作用尚不清楚。本研究结果显示，抑制miR-141-3p可以导致MDA、ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和细胞凋亡率增加，SOD活性降低，表明miR-141-3p能加剧低氧诱导的PC12细胞损伤。进一步的结果发现，miR-141-3p可以逆转丙泊酚对低氧处理的PC12凋亡，氧化应激和炎性反应的影响。提示丙泊酚可以通过下调miR-141-3p的表达抑制低氧诱导的PC12细胞损伤。

总之，丙泊酚可以通过抑制miR-141-3p的表达，减轻低氧诱导的PC12细胞凋亡、氧化应激和炎性损伤。