间充质干细胞在肾脏疾病治疗中的应用进展

杨蕴钊，石美涵，周 诚，白雪源

解放军总医院第一医学中心 肾脏病学部 解放军肾脏病研究所 肾脏疾病国家重点实验室 国家慢性肾病临床医学研究中心，北京 100853

干细胞在再生医学展现的巨大治疗潜力获得了越来越多的关注，为各种炎性反应疾病和退行性病变提供了新的有效治疗方式[1]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是从各种组织分离的多能基质细胞，是干细胞的一个分支。MSCs能够通过多种方式如迁移至损伤部位、免疫抑制、抗氧化应激、促血管生成等特性发挥重要的作用。在肾脏疾病中，MSCs的研究也得到了越来越多的关注。本文总结了MSCs的作用机制及其在肾脏疾病的临床前研究及临床治疗方面的研究进展。

1 间充质干细胞的来源和特征

干细胞根据其来源可分为：胚胎干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞 (embryonic stem cell，ESCs)通常来源于着床前的囊胚，具有发育的多能性。Takahashi等[2]提取了在胚胎干细胞中表达但不在成熟细胞中表达的编码转录因子的相关基因Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4，将其导入成体细胞使其恢复到类似于胚胎干细胞的高度不成熟状态，被称作为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。但伦理和成瘤问题限制了它们的应用。MSCs是目前最受关注的成体干细胞，在骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带、羊水、牙髓等不同部位都被分离出了MSCs，MSCs具有多种功能，包括分化能力、免疫调节和促血管生成，使它们成为肾脏疾病治疗的理想候选者[1]。人类 MSCs 的一个重要特性是低表达主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子，不表达 MHC Ⅱ类分子，这意味着它们可以跨越 MHC屏障进行移植，不会引起显著的免疫排斥反应[3]。不同来源的MSCs具有不同的性质，主要体现在增殖速度、细胞因子谱和免疫调节能力。骨髓间充质干细胞(bone marrow-MSCs，BM-MSCs)是研究最广泛的MSCs，但BM-MSCs获取的途径具有较大创伤性，能够获取的MSCs在骨髓组织中仅占0.01%～0.04%[4]。脐带间充质干细胞(umbilical cord-MSCs，UC-MSCs)、脂肪间充质干细胞(adipose tissue-MSCs, AD-MSCs)、胎盘间充质干细胞(placenta-MSCs，AF-MSCs)是近年来获得更多关注的成体干细胞，相对于BM-MSCs，它们有着更小创伤的获取途径、更强的增殖能力和更强大的免疫抑制能力[5]。这可能是因为它们比BM-MSCs有着更早期的胚胎学起源，是理想的MSCs获取来源。

2 间充质干细胞的作用机制

2.1 MSCs的旁分泌作用

虽然最初提出MSCs可通过被诱导分化而参与组织的再生修复作用，然而这种方式非常低效，大量的研究证明MSCs的旁分泌作用是其主要的机制，MSCs的旁分泌作用主要通过在损伤部位分泌大量的生物活性细胞因子(主要包括抗炎因子、趋化因子、生长因子和细胞外囊泡)而发挥治疗作用[6]。MSCs分泌的趋化因子会募集巨噬细胞和淋巴细胞来分泌促炎因子，MSCs 并不是本身就带有天然免疫抑制特性的，它需要促炎因子的刺激才会更大量地分泌抗炎因子，这是MSCs介导免疫抑制的关键步骤[7]。MSCs分泌的吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白介素10(interleukin-10，IL-10)、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等抗炎因子对免疫细胞有着广泛的影响。其他方面，MSCs分泌的血管内皮生长因子、造血生长因子对炎性反应损伤后的血管重塑至关重要[3]。细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是MSCs衍生的膜封闭的颗粒，近期的研究发现在肾病的动物模型中，EV可以通过多种机制发挥作用[8]，是治疗肾脏疾病的一个新思路。

2.2 MSCs对免疫系统中的调控作用

MSCs对各种免疫细胞都有不同程度的影响。在固有免疫方面，MSCs 分泌的细胞因子可以调控树突状细胞(dendritic cell, DC)的成熟和迁移[9]。MSCs还可以被活化的 NK 细胞分泌的干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)诱导释放IL-10、IDO、PGE2等，抑制 NK 细胞的过度反应[10]。MSCs对巨噬细胞的调控主要是诱导促炎型的M1型极化为抗炎型的M2型。在适应性免疫方面， MSCs 主要是通过分泌抗炎因子TGF-β、IL-10、IDO等抑制T细胞向促炎型Th1、Th17分化，促进抗炎Treg细胞的分化[11]。

3 MSCs治疗肾脏疾病的基础和临床研究进展

3.1 MSCs治疗急性肾损伤

急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)指肾功能突然下降，导致尿素和其他含氮废物潴留以及细胞外液容量和电解质失调。AKI中肾小管的损伤主要是由缺血性和肾毒性引起的氧化应激和炎性反应，不同来源的MSCs通过多种机制对AKI实现保护作用。在抑制炎性反应上，主要是通过提高旁分泌抗炎因子来减轻肾脏组织的损伤[12]。在氧化应激方面，研究发现MSCs在AKI中通过上调醌氧化还原酶 1 和超氧化物歧化酶来拮抗和限制氧化还原反应[13]。血管损伤是 AKI 的早期病理生理变化，MSCs还可以通过调控血管内皮生长因子基因的表达，维持AKI损伤后血管生成[13]。此外，在AKI发病过程中补体系统是介导炎性反应重要介质之一， MSCs能够下调C5a/C5Ar和抑制 DC 的成熟并促进它们向耐受性免疫抑制表型的转变[14]。最近，许多研究表明恢复线粒体功能是 MSCs 修复AKI受损组织的潜在治疗靶点，其中涉及多个通路，例如MSCs可以通过SIRT3刺激肾小管细胞生长并增强线粒体功能，还可以通过影响PI3K /Akt和线粒体凋亡信号通路来恢复线粒体损伤[15]。

基于大量关于 MSCs 在 AKI中的临床前证据，关于MSCs治疗AKI的临床试验也得到了开展(表1)。有研究开展了关于MSCs预防AKI的Ⅰ期临床试验，5例患有潜在肾脏疾病的患者在心脏大手术后，为预防AKI的发生，在肾主动脉输注了MSCs，患者肾功能在术后均未恶化[16]。而在另一项临床试验中，156例心脏手术后患有早期AKI的患者接受 MSCs 治疗后在肾损伤方面并没有观察到明显的恢复信号[17]。当然这可能由于MSCs 治疗效果不如预防效果或者被持续的肾损伤所掩盖。有研究团队设计了一种MSCs的组合生物设备SBI-101，将受试者的血液超滤液在体外经MSCs调节后再输送回去，不过受限于入组患者多合并有严重基础疾病，并正在接受连续肾脏替代治疗，患者没有取得明显的临床改善。但是在细胞因子水平的检测上，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IFN-γ、IL-10、TGF-β1以及趋化因子MCP-1 (CCL2)、MCP-2 (CCL8) 和 MCP-3 (CCL7) 的变化验证了离体MSCs的干预方式与既往研究的MSCs调控促炎反应转变为抗炎反应的生物学一致[18]。为了更加具体地观察到MSCs的临床作用,有研究者提出了一套新的临床设计方案：建立更加同质性的入组患者，仅包括由肾小管上皮细胞损伤直接引起的 AKI 患者，排除了其他器官受损而病情严重的患者，将有助于更好地判断MSCs在AKI中的具体作用[19]。

3.2 MSCs 治疗糖尿病肾病

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最严重的并发症之一，也是导致终末期肾病的主要原因之一。免疫炎性反应是DN持续发展的驱动因素,炎性因子的释放促进巨噬细胞浸润肾小球和间质，与DN的恶化程度密切相关[20]。有研究发现BM-MSCs可以通过激活转录因子EB来调节巨噬细胞的分化以抑制小鼠DN的进展[21]。类似的研究结果也表明在DN大鼠中MSCs可以减轻肾脏的巨噬细胞浸润，下调IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌[22]。除了聚焦于巨噬细胞外， T细胞也被认为在DN进展中扮演着重要的角色，研究表明在DN大鼠中，MSCs可以通过抑制DC的成熟来影响T细胞的增殖和活化，从而改善肾脏局部炎性反应和纤维化[23]。此外，相较于只能模仿人类DN早期的链脲佐菌素(STZ)和高糖高脂饮食的DN动物模型，BTBR ob/ob小鼠是更理想化的DN模型，近来研究结果表明MSCs 在治疗BTBR ob/ob 小鼠模型中可以通过免疫抑制、抗氧化凋亡、自噬调节和维持线粒体稳态发挥作用[24]。当然在大多数已发表的研究结果中，不同来源的MSCs都显著改善了DN模型的血糖并降低 SCr、BUN 和尿蛋白等[25]。

相较于大量的基础研究，目前只有少数临床试验报告了 MSCs对于DN的安全性和治疗作用(表1)。一项针对DN的多中心RCT的临床试验采用MSCs相关产品——骨髓来源的间充质前体细胞(mesenchymal precursor cells, MPCs)进行治疗，入组的30 例患者在12 周随访中，MPCs组显示出更稳定的血浆清除率 (mGFR) 和肾小球滤过率(eGFR)[26]。虽然没有表现出显著的治疗效果，但没有患者产生针对供体 HLA 的持续抗体和发生不良事件。

3.3 MSCs治疗狼疮性肾炎

50%的系统性红斑狼疮(SLE)患者都会出现狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)，多达10%的LN会进展为终末期肾病[27]。LN被视为一种典型的免疫复合物肾小球肾炎，其特征是针对核抗原的自身抗体导致肾脏受累。一项纳入28 项动物实验的荟萃分析显示，在狼疮肾炎动物模型中，不同来源的MSCs 的治疗都显著降低狼疮小鼠的ds-DNA、ANA、SCr、BUN、蛋白尿。MSCs治疗组的炎性因子 IL-2、IL-12、IL-17和 IFN-γ也较对照组有一定程度的降低[28]。不仅如此，MSCs相较于常规免疫抑制治疗也展现了更好的效果，在对照环磷酰胺(CTX)的研究中观察到，MSCs组较CTX治疗组能够更好地恢复肾功能，表现为 MRL/lpr 小鼠血清和尿肌酐水平正常化[29]。在LN中,IgG、炎性免疫细胞和炎性因子是造成足细胞损伤的主要因素，UC-MSCs在患狼疮的B6.MRL-Faslpr小鼠中通过减少巨噬细胞浸润和将巨噬细胞极化为M2型恢复了足细胞足突之间的裂隙隔膜损伤，同时减少了 IgG 和 C3 在肾小球中的沉积[30]。B细胞高反应性在SLE发病机制中起重要作用，B细胞是调控自身免疫的重要靶点，而MSCs可以通过抑制 MRL/lpr小鼠中 BAFF(主要由 T 细胞和DC细胞表达来激活B细胞)的产生而抑制 B 细胞的过度活化[31]。此外， MSCs还可以剂量依赖性抑制LN鼠中的 Th17和Th1 淋巴细胞，促进Treg细胞的增殖[32]。这些都体现了MSCs在LN中的强大免疫稳态能力。

基于动物实验取得的大量令人鼓舞的结果，MSCs治疗LN的临床试验也相应得到了开展(表1)。最早开展的LN临床试验选用BM-MSCs 治疗4例难治性 SLE 青年患者，在12-18 个月的随访期间，所有患者肾功能损伤均得到缓解，血清C3降低[29]。有更大样本量的研究纳入了 81 例活动性和难治性 LN 患者进行BM-MSCs和UC-MSCs的治疗，在12个月的随访中，60.5%患者的肾脏炎性反应得到缓解[33]。在另一项临床试验中，50%患者的肾脏炎性反应在BM-MSCs治疗后的第4年得到完全缓解，仅5例患者(6%)死于非治疗相关事件，更进一步验证了MSCs的长期有效性和安全性[34]。一项多中心的RCT临床试验选用UC-MSCs治疗重症LN患者也取得了令人满意的结果[35]。然而并非所有的报道都是乐观的，昆明一项针对重症LN 患者的RCT临床试验中，UC-MSCs组并没有比标准免疫抑制剂组有额外的治疗效果，该项临床试验被迫中止[36]。当然这并不是意味着UC-MSCs没有起到免疫抑制的作用，重症LN的病情进展有可能会掩盖MSCs的作用。

3.4 MSCs治疗原发性肾小球疾病

肾小球肾炎 (glomerulonephritis，GN) 常由各种病因诱发的自身免疫反应引起，是导致终末期肾病的常见原因。相较于AKI、DN、LN， MSCs在肾小球疾病的研究没有得到太多的关注，可能由于GN通常起病隐匿，治疗效果需要较长周期的验证，难以确定最佳治疗时机。

3.4.1 MSCs治疗抗肾小球基底膜 (anti-glomerular basement membrane, anti-GBM) 肾炎:肾小球肾炎中最严重和进展最快的病理类型是以肾小球新月体形成为主的抗肾小球基底膜肾炎，常会在短期进入终末期肾病。其主要机制是其针对基底膜Ⅳ型胶原蛋白 α-3 链的循环抗体与基底膜结合并引发炎性反应。有研究首先报道了hBM-MSCs在患有anti-GBM肾炎的 Wistar-Kyoto大鼠发病早期的治疗作用, hBM-MSCs显著降低了anti-GBM肾炎大鼠的尿蛋白水平和血清肌酐水平，减少了肾小球新月体形成，其治疗机制可能与调控Th1/Th2和Th17/Treg细细胞的平衡、抑制过度的免疫炎性反应有关[37]。有趣的是该团队的另一项研究利用MSCs 衍生的条件培养基 (MSCs-conditioned media，MSCs-CM)也显示出对anti-GBM肾炎大鼠的治疗作用[38]，MSCs-CM通过影响MCP1促进M1型巨噬细胞向M2的极化转变，减轻体内免疫炎性反应，而对Th1/Th2 和Th17/Treg没有明显影响。此外，一些研究利用MSCs作为载体，将一些已经证实对anti-GBM肾炎有抑制作用的基因传导到MSCs中，如激肽释放酶[39]、谷胱甘肽 S-转移酶 Mu 2[40]、抗氧化基因1[41]，结果表明转基因过后的MSCs可以更大程度地抑制炎性细胞因子的表达，减少巨噬细胞和 T 淋巴细胞向肾脏的浸润。这些发现推动了转基因 MSCs 作为新的方式靶向治疗肾脏疾病。

表1 在Clinical Trials注册已经完成或终止的有关MSCs治疗人类肾病的临床试验总结

3.4.2 MSCs治疗系膜增生性肾小球肾炎(mesan-gial proliferative glomerulonephritis，MsPGN):MsPGN是一种以系膜细胞增生及系膜基质增多为主要病理特征的肾炎，抗Thy1.1肾炎是最经典的MsPGN动物模型，通过注射抗Thyl.1单克隆抗体可特异性识别大鼠肾小球系膜细胞表面Thyl.1分子，进而导致补体依赖性系膜溶解和肾小球内炎性细胞浸润及明显的蛋白尿产生。有研究表明通过肾动脉注射BM-MSCs可以显著改善Thy1肾炎的系膜细胞溶解，并降低蛋白尿的水平[42]。在另一项研究中，胎膜来源的MSCs移植Thy1大鼠后抑制系膜细胞的增殖、巨噬细胞浸润、系膜基质积聚以及细胞外基质相关分子的表达[43]。

3.4.3 MSCs治疗局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS):FSGS是由对足细胞有损伤的循环因子、药物、毒物所引起的肾小球疾病，主要的病理特征是弥漫或者阶段性的足突消失。嘌呤霉素氨基核苷大鼠肾病模型(PAN)与阿霉素大鼠肾病模型是两种常见的FSGS啮齿类动物模型，具有类似人FSGS的病理特征。有研究表明在PAN模型中BM-MSCs可以通过调节肾脏中的Th1向Th2 细胞分化来实现对足细胞的保护[44]。此外，还有一些MSCs治疗阿霉素大鼠肾炎的研究结果表明，MSCs可以通过增加肾基质金属蛋白酶/金属蛋白酶-1的比率，下调IL-6 和 TNF-α炎性因子的表达，抑制RAS的表达和MAPK信号通路的激活等多方面发挥作用[45-46]。另一项研究是通过对FSGS家族患者的肾脏穿刺获得的组织进行外显子测序，发现了新的基因突变位点，利用基因编辑技术构建的p.Gly1617ValfsX15突变小鼠具有FSGS的病理特征，并发现hUC-MSCs可以通过影响IL-22来改善FSGS小鼠的早期病情进展[47]。

MSCs用于治疗肾小球肾炎的临床研究并不多，大多是一些病例报道。有研究报道了一例自体BM-MSCs治疗抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil-cytoplasmic antibody,ACNA)相关肾血管炎的临床研究，一例73岁男性ACNA患者在经历利妥昔单抗治疗伴发严重的自身感染和标准免疫治疗无效后选择了自体BM-MSCs移植，12个月的随访中，患者在没有其他任何治疗方式干预的情况下达到了临床缓解[48]。另有报道一例13 岁男孩在肾移植后出现了FSGS，鉴于免疫抑制剂治疗后的肾毒性作用所引起的肾小管萎缩和间质纤维化，患者接受了同种异体BM-MSCs 移植，22 个月的随访显示，循环免疫炎性因子减少并且无不良事件发生[49]。当然，从这些单一的病例中尚不能得出多种MSCs对GN明确有效的结论，更多GN患者大型队列的建立将有助于MSCs在该领域临床研究的进展。

4 总结与展望

大量临床前研究都证实了MSCs在肾脏疾病具有保护作用，免疫调节被认为是一个很重要的治疗机制，包括抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡的作用。目前的关键在于如何最大限度地发挥 MSCs 的治疗效果，迄今已经提出了几种提高 MSCs治疗效率的方法，如预处理(生理、药物、物理)和基因修饰。经过一定方式预处理后的MSCs比常规的MSCs有着更好的治疗效果，如缺氧刺激后的MSCs在治疗Thy1肾炎中可以更加有效地减少肾小球细胞凋亡和炎性反应[57]。二甲双胍环境培养的AD-MSCs在治疗LN小鼠时明显增强了MSCs的免疫调节功能[58]。预处理似乎是一种刺激MSCs发挥更理想效果的方法。此外，MSCs的治疗时间点是一个关键，MSCs在大多数动物实验中都显示出了一定的疗效，但是大多数的治疗都是在疾病模型的早期开展的，而对MSCs长久的影响关注较少，有研究显示在动物模型的病情后期，MSCs 向脂肪异常分化并发生纤维化[59]，这可能是MSCs远期的不良影响。在临床试验方面，尽管MSCs所取得的效果仍然存在争议，但MSCs的安全性和低致敏性得到了验证。还有一点需要考虑的是，在大多数肾病的治疗中常会联合免疫抑制剂和糖皮质激素，而在临床试验中发现标准剂量的免疫抑制剂和糖皮质激素会干扰MSCs功能，但不影响其免疫抑制特性[60]。所以在联合使用免疫抑制药物、糖皮质激素和MSCs之前，应考虑以上问题。除此之外，临床试验中还有许多关键问题尚待解决，包括确定最佳细胞类型、给药途径和时机，以及细胞剂量和次数。总之，如何更加有效地发挥MSCs的治疗作用还亟待于今后更多的研究。