嗜酸乳杆菌LA-Y26高密度培养工艺条件优化

◆作者：谭文俊，张文，欧豪，潘杰华，向健

◆单位：清远一生自然生物研究院有限公司

嗜酸乳杆菌（Lactobacilus acidophilus）属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，是一种重要的益生菌，其形态多数呈现细长杆状，分布较杂乱，以单个、成双或短链出现，菌落边缘较粗糙且不规则，通常呈中间向两边放线状分布，颜色较透明。嗜酸乳杆菌具有改善肠道健康、调节免疫、减轻肥胖、治疗肠道疾病等众多益生功能。众多试验研究证明了嗜酸乳杆菌对治疗腹泻和缩短腹泻时间有一定的功效，能够很好地定殖于动物肠道，有效抑制致病菌的生长，调节宿主的菌群平衡。在其生长过程中会产生对病原菌和腐败菌有一定的拮抗作用的代谢产物，能够有效地抑制体内有害微生物的生长和繁殖以及毒素的分泌，起到平衡宿主肠道微生物菌群的作用，从而治疗由致病菌引起的腹泻。嗜酸乳杆菌在食品、药品及饲料添加剂中均有应用，市场需求巨大。

本研究通过单因素实验及正交试验对嗜酸乳杆菌LA-Y26发酵培养基和培养条件进行优化，为嗜酸乳杆菌LA-Y26高密度培养及工业化生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌种、试剂和设备

1.1.1 菌种和试剂

菌种：嗜酸乳杆菌LA-Y26，分离自健康育肥猪肠道菌群，由本实验室保藏；MRS培养基：按照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》方法配置；无水葡萄糖：广州化学试剂厂；乳糖：阿拉丁试剂（上海）有限公司；甘露糖：阿拉丁试剂（上海）有限公司；麦芽糖浆：广州双桥股份有限公司；蔗糖：市售；蛋白胨；大豆蛋白胨；胰蛋白胨；牛肉浸粉；酵母提取粉均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 设备

电子天平：梅特勒托利多科技（中国）有限公司；高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1菌种活化

将嗜酸乳杆菌LA-Y26冻干管接入MRS液体培养基中，37.0℃培养20h，活化二代；

1.2.2 种子培养

将活化后的菌种按体积分数5.0%接种到装有200mL MRS培养基的250mL三角瓶中，37.0℃培养20h。

1.2.3 嗜酸乳杆菌LA-Y26培养基优化

以MRS液体培养基为起始培养基，选择添加量均为10.0g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖浆、乳糖、甘露糖作为碳源，进行碳源优化试验；选择添加量均为10.0g/L的大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉作为氮源，进行氮源优化试验；选择添加量为1.0g/L的叶酸、生物素、维生素B1、天冬氨酸、赖氨酸进行促生长因子优化试验。在三角瓶中进行试验，37.0℃培养20h进行发酵液活菌计数，初步确定培养基成分。

在上述优化后的培养基基础上，选择最佳碳源、氮源、促生长因子进行正交试验，得到最佳碳源、氮源、促生长因子的最佳添加量。

1.2.4 嗜酸乳杆菌LA-Y26三角瓶培养条件优化

在上述正交试验基础上，考察不同接种量、初始pH值、培养温度、转速及培养时间对嗜酸乳杆菌LA-Y26生长情况的影响，确定较优的三角瓶培养条件。

1.2.5 嗜酸乳杆菌LA-Y26发酵罐验证

在20L规模发酵罐进行小试试验，将种子接种至装有12L培养基的20L发酵罐中，按照1.2.4最优条件进行培养，取样检测活菌数，验证优化后的培养基配方和培养条件。

2 结果和分析

2.1 嗜酸乳杆菌LA-Y26培养基优化结果

2.1.1 碳源优化结果

碳源是发酵培养基中主要的能量来源，充足的碳源有利于菌体的生长。由图1可见，MRS培养基为对照，以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖浆、乳糖和甘露糖为碳源的培养基种，嗜酸乳杆菌活菌数量分别为2.7×108、4.1×108、3.8×108、3.6×108、4.9×108、3.2×108CFU/mL。以乳糖为碳源的培养基，嗜酸乳杆菌生长状态明显优于其他成分的培养基，葡萄糖、蔗糖次之。

图1 不同碳源对嗜酸乳杆菌LA-Y26活菌数的影响

2.1.2 氮源优化结果

氮源是构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料，用于菌体细胞物质和含氮代谢物的合成，充足且易于利用的氮源有利于细胞快速分裂。由图2可见，MRS培养基为对照，以大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉为氮源的培养基中，嗜酸乳杆菌活菌数分别为2.9×108、5.3×108、4.7×108、3.8×108、4.3×108、3.6×108CFU/mL。以大豆蛋白胨为氮源的培养基，嗜酸乳杆菌生长状态明显优于其他成分的培养基，酶水解酪蛋白、乳清粉次之。

图2 不同氮源对嗜酸乳杆菌LA-Y26活菌数的影响

2.1.3 促生长因子优化结果

嗜酸乳杆菌依赖于培养基提供某些生长必需的维生素、氨基酸，在培养基中添加促生长因子，可提高氮源利用率，促进嗜酸乳杆菌生长。由图3可见，MRS培养基为对照，添加量为1.0g/L的叶酸、生物素、维生素B1、天冬氨酸、赖氨酸时，嗜酸乳杆菌活菌数分别为3.0×108、4.7×108、5.5×108、4.2×108、6.1×108、5.6×108CFU/mL。以天冬氨酸为促生长因子时，嗜酸乳杆菌生长状态明显优于其他成分的培养基，赖氨酸、生物素次之。

图3 促生长因子对嗜酸乳杆菌LA-Y26活菌数的影响

2.2 正交试验

根据上述单因素试验结果，选择乳糖、大豆蛋白胨、天冬氨酸进行三因素三水平正交试验，考察碳源、氮源及促生长因子对嗜酸乳杆菌LA-Y26生长的影响。由表1可见，乳糖、大豆蛋白胨及天冬氨酸的影响顺序为乳糖＞天冬氨酸＞大豆蛋白胨，较优组合为乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，按照最优组合进行三角瓶培养试验，发酵液活菌数最高可达35.7×108CFU/mL。

表1 嗜酸乳杆菌LA-Y26发酵培养基优化正交试验

2.3 嗜酸乳杆菌LA-Y26三角瓶培养条件优化

2.3.1 接种量优化

根据上述正交试验最优结果配置培养基，分别按1.0%、3.0%、5.0%、10.0%接种量接种，37.0℃培养20h，发酵液在MRS琼脂涂布计数。由表2可见，当接种量在3.0%时，嗜酸乳杆菌LA-Y26发酵液活菌数最高可达37.5×108CFU/mL。

表2 不同接种量对嗜酸乳杆菌LA-Y26活菌数的影响

2.3.2 初始pH值优化

根据上述试验结果，调整发酵培养基初始pH为5.5、6.0、6.5、7.0，按3.0%接种量接种，37.0℃培养20h，发酵液在MRS琼脂涂布计数。由表3可见，当初始pH值在6.0时，嗜酸乳杆菌LA-Y26发酵液活菌数最高可达42.7×108CFU/mL。

表3 不同初始pH值对嗜酸乳杆菌LA-Y26活菌数的影响

2.3.3 培养温度优化

根据上述试验结果，按初始pH值6.0，3.0%接种量接种，调整培养温度为28.0℃、32.0℃、37.0℃、42.0℃，培养20h，发酵液在MRS琼脂涂布计数。由表4可见，当培养温度为37.0℃时，嗜酸乳杆菌LA-Y26发酵液活菌数最高可达43.9×108CFU/mL。

表4 不同培养温度对嗜酸乳杆菌LA-Y26活菌数的影响

2.3.4 转速优化

根据上述试验结果，按初始pH6.0，3.0%接种量，培养温度37.0℃，调整转速为0、50、100、200r/min，培养20h，发酵液在MRS琼脂涂布计数。由表5可见，当转速为50r/min时，嗜酸乳杆菌LA-Y26发酵液活菌数最高可达63.1×108CFU/mL。

表5 不同转速对失算乳杆菌LA-Y26活菌数的影响

2.3.5 嗜酸乳杆菌LA-Y26生长曲线

根据上述试验结果，按初始pH6.0，3.0%接种量，培养温度37.0℃，转速50r/min，间隔2h取样检测发酵液OD600nm及活菌数，考察嗜酸乳杆菌LA-Y26最佳培养时间。由图4可见，随培养时间不断增加，发酵液的OD600nm值和活菌数同步呈上升趋势，培养6h嗜酸乳杆菌LA-Y26进入对数生长期，培养20h后进入稳定期。随着培养时间的延长，发酵液的OD600nm及活菌数均呈略微下降趋势，因此嗜酸乳杆菌LA-Y26最佳培养时间为20h。

图4 嗜酸乳杆菌LA-Y26生长曲线及活菌数

2.4 20L发酵罐试验结果

在20L发酵罐中，配置MRS培养基和优化培养基，按照相同的优化条件培养嗜酸乳杆菌LA-Y26。结果表明，使用优化后的培养基培养，嗜酸乳杆菌LAY26在20L发酵罐中的发酵液活菌数最高可达82.1×108CFU/mL，约为MRS培养基的40倍。

3 结论

本研究通过优化培养基及培养条件，实现了嗜酸乳杆菌LA-Y26的高密度培养，优化后培养基为乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，吐温80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L；培养条件为初始pH6.0，接种量3.0%，温度37.0℃，转速50r/min，培养时间20h。在20L发酵罐中进行多次验证试验，发酵液活菌数最高可达82.1×108CFU/mL，约为MRS培养基的40倍。按优化后的培养基和培养条件进行多次500L、1000L发酵罐试验，结果表明，发酵液活菌数比优化前水平有大幅度提升。

参考文献：（略）