基于干旱环境中大鼠泪腺差异表达蛋白的筛选初探“燥伤清窍”机理

郝冉，崔阿圆，王丽鑫，张旺旺，史红

中国西北偏西地区常年降水量少，相对湿度偏低，植被稀疏，沙漠广布，干旱、半干旱是其主要的自然特征。有中医学者[1]将此自然特征总结为“燥气偏盛，燥发无时，非独秋有”，并指出此燥（干旱、半干旱）不同于“因时而至”之秋燥（四季中秋季相对湿度偏低）。当防护不当或禀性不耐时，干旱、半干旱区特有的气候环境因素可导致人体罹患“西北燥证”，即以口鼻、眼睛、咽喉、肌肤干燥、干咳、烦躁等不适症状为特征的一组中医综合证候，因其发生于西北地区，且以干燥症状为主，故称之为“西北燥证”[2]。本研究前期以整体观念为指导，在探索“燥邪伤肺”微观机制之时，不仅观察到鼻黏膜、气道和肺组织的病理变化[3]，还观察到干旱环境中健康大鼠泪腺腺泡的萎缩融合，腺体组织中β-防御素-2（β-defensins-2）的表达发生异常变化[4]。为此，本文通过初步筛选和分析泪腺中的差异表达蛋白（以下简称差异蛋白），以期找到“燥伤清窍”分子机制的候选靶标，为今后从急性眼表损伤相关指标（包括结膜杯状细胞和睑板腺功能等）出发探索“燥伤清窍”的机理提供有价值的线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄SPF级雌性SD大鼠20只，体质量140～160 g，购自新疆医科大学动物实验中心[许可证号为SCXK（新）2018-0002]。本研究实验动物及条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定，由新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准（伦理审批号：IACUC-20150225-102）。

1.2 试剂与仪器

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（中国碧云天生物技术有限公司，P0011），串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）试剂盒、乙腈（美国Thermo Fisher Scientific 公司，WD330302、F22M6E20 1），三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫苏糖醇、尿素（美国Sigma-Aldrich公司，BCCD4553、WXBC8963V、SLCD4701、WXBD4821V），胰酶（美国Promega 公司，SRT220102），甲酸（美国Fluka公司，0172192381）。

改造后的程控智能人工气候箱（上海德洋意邦仪器有限公司，PRX-1250B），砂尘试验箱（常州市金坛博科实验设备研究所，DSC-1000），蛋白电泳仪（上海天能科技有限公司，EPS-300），高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，1260），1200 纳升级液相色谱仪、质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司，EasynLC 1200、Q Exactive HF-X）。

1.3 实验室模拟干旱环境

基于气象数据分析结果[5]，项目组建立了实验室人工模拟干旱环境的具体方案[6]，并在前期动物实验研究[3-4]中证实方案可行。具体模拟方法是人工气候箱按时段设置温度，每个时段为2 h，每日共12 个时段，代表子时（23:00～次日0:59）～亥时（21:00～22:59）。

在动物实验的第1～6 d和第25～30 d 温度范围为6～24 ℃，在第7～12 d 和第31～36 d 温度范围为16～34 ℃，在第13～18 d和第37～42 d温度范围为10～30 ℃，在第19～24 d 和第43～48 d 温度范围为-8～6 ℃，日均温差不低于18 ℃；设定相对湿度5%～45%，日均相对湿度为（24.33±11.29）%，风速3 m/s，光照强度5～20 LUX，递增或递减日照总时数以模拟春夏和秋冬的日照特点（表1）。设置砂尘试验箱风速6～8 m/s，浮尘（粒径＜10 μm，300 g/m³/次），吹尘时长20 min/次，2次吹尘间隔10 min，干预强度1 h/d。

表1 人工气候箱模拟干旱风沙环境时温度、湿度与光照度的设定

1.4 分组与处理

采用随机数字表法，按照体质量将20只雌鼠分为2 组，其中对照组（control group，CG）饲喂在常温（20.5～21.5 ℃）常湿（相对湿度50%～55%）环境；干旱风沙组（dryness &sand dust group，DD）饲养在人工气候箱和砂尘试验箱模拟的干旱风沙环境中48 d（即人工燥邪的1 个气候周期），实验结束后大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后腹主动脉采血，摘取大鼠左侧泪腺组织，使用0.9%氯化钠注射液清洗3 遍，装于冻存管中，迅速放入液氮后转移至-80℃超低温冰箱保存。

1.5 测试分析

提取泪腺组织蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。胰酶将蛋白酶分解成肽段，TMT 标记肽段。高效液相色谱法对标记的肽段分级。EASY-nLC 1200超高效液相系统流动相A（0.1%甲酸和2%乙腈水溶液）和流动相B（0.1%甲酸和90%乙腈水溶液）对分级后的肽段分离，分离后的肽段被注入电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）中进行电离，Q Exactive HF-X 质谱进行分析。高分辨的轨道离子阱（Orbitrap）检测和分析肽段母离子及其二级碎片。用数据依赖型扫描（data-dependent acquisition，DDA）程序采集数据。Maxquant（v1.5.2.8）检索二级质谱数据。

1.6 差异蛋白的筛选和统计学方法

每个样本重复3 次全蛋白定量测试，分别采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、相对标准差（relative standard deviation，RSD）和Pearson 相关性分析评估蛋白定量重复性。计算出每个样本在多次全蛋白定量重复实验中定量值的平均值，再计算2个样本之间平均值的比值，该比值是比较组最终的差异表达量（即相对定量）。将各样本中某蛋白的相对定量值进行log2 对数转换，以使数据符合正态分布，用组间双尾t检验的方法计算P值。当P＜0.05 时，以差异倍数≥1.2 作为显著上调的变化阈值，差异倍数＜1/1.2 作为显著下调的变化阈值。

1.7 差异蛋白的生物信息分析

UniProt-GOA 和InterProScan数据库对鉴定出的差异蛋白进行基因本论（gene ontology，GO）分析，从细胞组成、分子功能及生物过程3个方面对差异蛋白进行GO 功能注释和富集。京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库对差异蛋白进行通路富集分析：使用KEGG在线服务工具（KEGG Automatic Annotation Server，KAAS）对差异蛋白进行注释后，通过KEGG mapper将注释后的蛋白与数据库中相应的通路匹配。

2 结果

2.1 DD组大鼠泪腺中的差异蛋白

经技术重复后样本的蛋白定量结果符合统计学上的一致性。筛选出DD组差异蛋白共计505个，表达上调和下调的蛋白分别有210 个和295 个（图1）。本研究DD 组泪腺中的部分差异蛋白如表所示（表2）。

表2 干旱风沙组大鼠泪腺中的差异蛋白

图1 干旱风沙组大鼠泪腺中的差异蛋白定量重复性检验的统计图

2.2 DD组大鼠泪腺中差异蛋白GO功能注释结果

DD 组大鼠泪腺中上调和下调差异蛋白数位居前2 位的生物进程均是细胞过程和单生物过程，其主要上调差异蛋白是S100 钙结合蛋白A9（S100 calbindin A9，S100A9）和免疫球蛋白γ-2A 链C 区（Ig gamma-2A chain C region,IgG2a）。上调和下调蛋白数位居前2 位的细胞组成是细胞和细胞器，主要上调差异蛋白均有S100A9。此外，细胞中还有IgG2a，细胞器中有三磷腺苷合酶抑制因子1。上调和下调蛋白数位居前2位的分子功能是结合和催化活性，其中结合功能中主要上调差异蛋白是S100A9和免疫球蛋白γ-2A链C区，催化活性功能中主要上调差异蛋白有E3 泛素蛋白连接酶和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）（图2）。

图2 差异蛋白GO二级分类统计图

2.3 DD组大鼠泪腺中差异蛋白GO功能富集结果

DD 组大鼠泪腺中上调差异蛋白在生物进程方面主要富集在其他生物体的防御反应（IgG2a）、质膜内陷（IgG2a）、对细菌的防御反应、吞噬作用（IgG2a）和B 细胞介导免疫（IgG2a）。在分子功能方面则是免疫球蛋白受体结合和蛋白质二硫键异构酶活性。在细胞组成方面为细胞外间隙、循环免疫球蛋白复合物和免疫球蛋白复合物。在生物进程方面下调差异表达蛋白主要富集在横纹肌收缩、氢传输、胶原原纤维组织和单价无机阳离子转运。分子功能方面则富集在肌动蛋白丝结合、细胞外基质结构成分和肌动蛋白结合方面。细胞组成方面富集在收缩纤维、收缩纤维部分、横纹肌细丝和肌丝方面（图3）。

图3 差异蛋白GO功能富集

2.4 DD 组大鼠泪腺中差异蛋白的KEGG 通路富集结果

DD 组大鼠泪腺中上调差异蛋白主要富集在抗原加工呈递、哮喘等相关通路（图4A、图5）；下调差异蛋白主要富集在氧化磷酸化、帕金森病、蛋白质消化和吸收等通路（图4B）。

图4 差异蛋白的KEGG通路富集

图5 上调差异蛋白富集的主要信号通路

3 讨论

《素问·阴阳应象大论》[7]曰：“燥胜则干”，指出燥邪易伤津液，导致机体出现干涩、坚敛之变。燥易伤肺，肺失宣肃，清窍失养则可症见目、口鼻、咽喉干燥，干咳，大便干燥，小便短赤等“外燥”之象。干旱、半干旱区“燥气偏盛”，防护不当或体质异禀时，特有的环境因素可作为危险因素导致机体处于亚健康状态[2]，抑或诱发疾病的发生。如赵孝国等[8]的研究证实，干旱风沙环境作为诱因可致口舌、目鼻、咽喉等暴露性器官“干涩”不适，甚则病发急慢性结膜炎等。周铭心等[2]将“眼干”“眼痒”“目眵多”等眼部症状作为辨识西北燥证主证（又称肺卫孔窍皮肤燥证）的主要依据之一，故本文从“外燥”影响“眼部外候”探索“燥伤清窍”的机理。

泪膜覆盖于眼前表面，从表到里依次为脂质层、水液层（由泪腺和副泪腺分泌）、黏液层，是眼表的保护层，其稳态与眼表健康密切相关[9]。泪液属人体津液[10]，也是泪膜的重要组分。结合干旱环境中健康大鼠外周血CD4+/CD8+值异常升高[11]，泪腺腺体萎缩[4]等研究结果，本研究着眼于炎症反应、变态反应和细胞凋分析差异蛋白，并初步选定探索外燥证“燥伤清窍”机制的候选靶标。

S100A9 常与S100 钙结合蛋白A8 形成异源二聚体，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路，诱导炎症反应[12]，也能刺激白细胞募集和细胞因子分泌而调节炎症反应。α-1-酸性糖蛋白（alpha-1-acid glycoprotein，AGP1）在炎症或感染时，可通过调节细胞因子白细胞介素-1和白细胞介素-6 参与免疫调节。S100A9 和AGP1 均被证实为干眼泪液中的生物标志物[13]，故S100A9 和AGP1 是较为理想的眼表炎症反应相关的候选靶标。

其次，趋化因子C-X3-C 基元配体1（chemokine C-X3-C motif ligand 1，CX3CL1）可诱导白细胞黏附与迁徙，趋化B 细胞和T 细胞，调控炎症进程并引发免疫损伤，其表达与干眼症状的严重程度正相关[14]。而存在于中性粒细胞和单核细胞中的MPO 则可利用过氧化氢形成具有氧化能力的自由基，进而参与机体的氧化应激[15]，导致眼表组织损伤。下调蛋白泛醇-细胞色素C 还原酶铰链蛋白（ubiquinolcytochrome c reductase hinge protein，UQCRH）则能通过减少氧化损伤调节线粒体功能，从而对抗慢性疾病中的氧化应激反应[16]。在本研究中UQCRH 表达水平降低，UQCRH 抗氧化损伤的功能减弱，可能会减轻对抗眼表的氧化应激反应的作用，从而产生干眼症状。MPO 和UQCRH 均参与机体氧化应激反应，而氧化应激反应对眼表上皮有直接的促炎作用，能引发二次免疫反应，从而加剧眼表损伤[17]。因此，CX3CL1、MPO 和UQCRH 蛋白也可作为眼表炎症反应相关的候选靶标。

T-激肽原1（T-kininogen 1，KNT1）在激肽释放酶作用下可以生成激肽，激肽释放酶-激肽系统所有成分都存在于眼中并参与调节眼部血流量，炎症急性期时KNT1 表达增加表达增加。蛋白酶体亚基β-8（proteasome subunit β type-8，PSMB8）为免疫蛋白酶体，是炎症反应的重要成分和调节剂，在内源性抗原加工呈递中起关键作用，抗原加工呈递对适应性免疫至关重要。下调蛋白血清转铁蛋白（serotransferrin，TF）在细胞内外铁离子代谢平衡中发挥重要作用，具有抗微生物的功能，与细胞的生长分化和细胞保护功能有关，是眼表天然的免疫系统。TF在干眼初期水平降低，其对眼表的保护作用减弱，同时导致泪液中铁离子失平衡而损伤细胞[18]，因此TF 的下调提示DD 组大鼠可能出现干眼症状。故KNT1、PSMB8、TF 可作为眼表炎症反应相关的候选靶标。

差异蛋白前列腺素D 合酶（prostaglandin D synthase，PGDS）可催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）使其转化为前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2），后者是诱导过敏反应和炎症反应的重要介质。IgG2a 是免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的一个亚型，与IgG Fc 段受体（Fc gamma R，FcγR）结合可诱导全身性过敏反应。研究[2]证实，罹患西北燥证（尤指肺卫孔窍皮肤燥证）者过敏性鼻炎发病率高于未罹患西北燥证者。过敏性鼻炎表现为鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻黏膜肿胀等症状，常伴眼痒或眼干，故推测PGDS和IgG可作为与眼表过敏反应相关的主要候选靶标。

差异蛋白热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、酪蛋白激酶Ⅱα'亚基（casein kinase 2 alpha 2，CSNK2A2）、泛素羧基末端水解酶L3（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L3，UCHL3）和S100A9均是与眼表细胞凋亡相关的候选靶标。HSP27为在应激反应中被高度诱导的蛋白之一，可通过与含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和细胞色素C（cytochrome C，Cytc）结合，使Caspase级联失活，从而阻止细胞凋亡，HSP27 的上调提示泪腺细胞凋亡可能存在异常增强的趋势。下调蛋白CSNK2A2是酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase II，CK2）的催化亚基，可磷酸化多种底物，调节细胞周期进程、细胞凋亡和转录等细胞过程。CSNK2A2 能促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。CSNK2A2 在许多肿瘤细胞中呈高表达，抑制肿瘤细胞凋亡[19]。下调蛋白UCHL3 属于去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）中泛素羧基末端水解酶（ubiquitin terminal hydrolase，UCHs）家族，从蛋白质底物中去除泛素，保护蛋白质免于降解，并且释放游离泛素参与循环泛素化反应，能够调节细胞过程，例如细胞生长、分化、发育和凋亡等。泛素化是调节细胞凋亡的途径，许多凋亡因子通过泛素化调节细胞凋亡。有研究[20]表明，UCHL3水平降低导致细胞中的促凋亡因子P53 蛋白、B 淋巴细胞瘤-2 相关X 蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、Caspase-3 增加，从而促进细胞凋亡。在本研究中，CSNK2A2 和UCHL3 呈低表达，可以促进泪腺细胞凋亡，与DD 组大鼠泪腺组织病理表现泪腺细胞萎缩相印证。此外，S100A8/S100A9 可改变促凋亡和抗凋亡蛋白间的平衡诱导细胞凋亡。故HSP27、S100A9、CSNK2A2 和UCHL3 和可以作为泪腺凋亡的候选靶标。

综上所述，S100A9、AGP1、CX3CL1、MPO、UQCRH、KNT1、PSMB8、PGDS、IgG、HSP27、TF、CSNK2A2 和UCHL3 等候选靶标的验证结果可用于从炎症反应、过敏反应和细胞凋亡的角度，选择有价值的信号通路从眼部症状探索“燥伤清窍”的机理。此外，本研究基于蛋白表达对“燥伤清窍”的机制进行了初步探索，目的在于挖掘燥邪损伤机体的微观机制，故目前研究尚未涉及动物模型的建立与评价，也未能就燥邪干预下眼表急性损伤机制、共患疾病对眼表微环境中炎性因子或凋亡因子水平，及雌激素水平与泪腺分泌及蛋白表达的相关性等进行更深入研究，故所获研究结论仅具导向性价值。