产油微生物制备生物柴油的研究进展

姜岩，李玉欣，陈立功，李文杰

(1.重庆工商大学 废油资源化技术与装备教育部工程研究中心，重庆 400067；2.哈尔滨工业大学(威海) 海洋科学与技术学院，山东 威海 264209)

生物柴油是一种重要的可再生能源，可以无限的生产，并具有许多环境友好的特性，如含硫量低、更易被降解，并且不包含对环境造成污染的芳香族化合物。由于用植物油为原料生产成本高且产量有限，而以餐饮废弃油为原料，也存在原料难以收集等问题，利用微生物油脂发酵成了一个重要的研发方向[1-2]。

单细胞油脂的组成和一般植物油相近，以C16和 C18脂肪酸，如油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸等为主，但不饱和度更高[3]，因而生产的生物柴油的品质好[4]。利用微生物油脂制备生物柴油具有很多优势，如：微生物生长迅速、生长周期短、生长原料广泛且价格便宜；可以人工调控且需要劳动力少；受季节、场地、环境制约小；能连续大规模生产，生产成本较低[5]。因而通过微生物法制备生物柴油对柴油产业可持续发展具有重要意义。本文对产油微生物的种类、筛选和微生物柴油的制备流程进行了综述，并对未来的研究方向进行了展望。

1 产油微生物的研究现状

部分微生物在适宜条件下生产并储存的油脂含量占其生物总量的20%以上，具有这种特性的菌株一般被称为产油微生物[6]。目前，已发现的产油微生物包括酵母菌、霉菌、藻类和细菌等。其中，酵母菌作为单细胞真核微生物，常见的产油菌有产油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、弯隐球酵母(Cryptococcusalbidum)、浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、弯假丝酵母(Candidacurvata)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、胶粘红酵母 (Rhodotorulaglutinis)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、茁芽丝孢酵母(Trichospironpullulans)、双倒卵形红冬孢酵母(Rhodosporidiumdiobovatum)等[7-8]，这类菌株细胞内油脂含量较高，可达菌体干重的30%～70%。霉菌是形成分支菌丝的真菌统称。目前发现的常见产油霉菌有深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、葡酒色被孢霉(Mortu-erellavinacea)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、紫癜麦角菌(Clavicepspurpurea)、高梁褶孢黑粉菌(Tolyposporiumehrenbergii)等[9-10]。霉菌油脂含量约为菌体干重的20%～70%。此外，海洋中许多藻类都能产生油脂，其中微藻以其独特的优点在产油藻类中凸显出来，近年来成为了研究的热点。微藻个体小，平均大约只有5 mm，生长繁殖快，对外界环境适应力强，在陆地、海洋分布广泛，几乎在有光和潮湿的任何地方，微藻都能生存，并且产油培养过程容易，对光的利用效率高。目前，已经发现了几百种富油微藻，直接提取得到的油脂组分与植物油类似，可以作为植物油的替代品，更是优良的生物柴油生产原料。现已发现含油量较高的微藻有硅藻(Diatom)、绿藻(Chlorophyta)、葡萄藻(Botryococcusbraunii)、杜氏盐藻(Dunaliellasalina)、小球藻(Chlorellavulgaris)等[11]。藻类油脂含量约为菌体干重的25%～65%。相比之下，产油细菌油脂含量较低，为20%～40%，常见的有：分枝杆菌(Mycobacterium)和棒状杆菌(Corynebacterium)等。细菌在高葡萄糖时产生不饱和甘油三酸酯，但大多数产油细菌不产甘油三酯，而是积累复杂类脂，如磷脂与糖脂。由于细菌油脂主要分布于细胞外膜上，所以提取较为困难，故很难应用于工业生产。

2 产油微生物的筛选与培养

野生型产油菌株往往效率很低，因而高效诱变株成为发展方向。

传统诱变方法。即利用物理诱变剂(如α射线、γ射线、紫外辐射等)和化学诱变剂(如烷化剂、核酸碱基类似物等)等诱使微生物发生突变，进而筛选出高产油菌株的诱变方法。Yamada等[12]通过紫外线得到了诱变酵母突变株，产脂率是野生型的5倍。

针对微生物油脂代谢网络，进行调整和结构优化，来提高细胞的油脂含量[8]。主要有以下几种思路：①增加油脂合成相关酶的表达量。Zhang 等[13]使圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的乙酰CoA羧化酶和二酰基甘油酰基转移酶基因过量表达，促使菌体油脂含量增加了2倍；②抑制脂肪酸β氧化途径。Courchesne等[14]通过部分抑制β-氧化可增加细胞油脂含量；③抑制中间代谢产物流向其他分支途径。Athanasios等[15]将编码3-磷酸甘油脱氢酶的GUT2基因敲除，使Δgut2突变株的油脂含量增加了 3 倍。

用转座子随机插入基因组，从而找出油脂合成相关基因。Kamisaka等[16]则通过转座子突变在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中发现5个能促进菌体油脂含量积累的基因。这条研究路线得到了较好的处理效果。

3 生物柴油的制备

生物柴油制备的主要过程为：发酵→菌体的收集与预处理→油脂提取→生物柴油制备。

3.1 发酵

发酵过程作适当优化调整可以提高油脂含量。除了通过控制通气量、温度、pH、光照，还可以控制营养元素的比例或添加一些小分子物质来提高油脂含量。①调整C/N比例。李永红等[17]发现C/N 比在一定范围内增加时，圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)油脂含量也随之增加，达到420 时，油脂含量达到最高值76%。②调整C/P比。李永红等[17]还发现C/P比适度增加，也会提高菌体油脂含量。③调整C/S比。Wu等[18]在研究Rhodosporidumtoruloides时发现，S同样起着很重要的作用，硫限制时，细胞油脂含量不再随C/N而变化。④添加其他一些小分子物质。Papanikolaou等[19]发现加少量甜橙精油到Yarrowialipolytica的培养基质中，便能使产物中饱和脂肪酸含量大幅增加。

另外还可以应用不同发酵模式调控油脂发酵。通常利用微生物生产胞内产物，可以采用的培养方式有3种：批式培养、补料-批式培养和连续培养。其中补料-批式培养模式可方便控制限制因子浓度，获得了广泛应用。Liang等[20]利用粗甘油为碳源培养Cryptococcuscurvatus，发现补料-批式培养条件下，在培养结束时，菌体量和油脂含量均比批式培养高。

3.2 菌体预处理

油脂多包含在菌体细胞内，为了提高油脂的萃取率，有必要在提取油脂之前对菌体细胞进行预处理，使得内部油脂更容易释放出来。菌体常见的预处理方法有：①基于机械剪切力的研磨、高压、激光、超声波、电场等；②反复冻融法，即利用低温冰冻后生成的冰晶达到破壁目的；③与稀盐酸共煮法，即是用一定浓度的稀盐酸对菌体细胞进行处理，破坏其细胞壁结构，再加热煮沸进一步使得细胞裂解；④菌体自溶法，如将酵母在50 ℃下保温 2～3 d，自行消化后回收油脂；⑤酶处理法，即用细胞壁降解酶，如木聚糖酶、纤维素酶等处理菌体；⑥有机溶剂处理，如利用乙醇或丙酮破坏细胞膜，使结合蛋白变性[21-23]。

预处理方法选择上还要根据原料材质决定[24]，研发高效低成本的预处理技术对后续油脂提取很重要。

3.3 油脂提取

油脂提取也是制备生物柴油的关键环节，常用的方法包括有机溶剂法、索氏提取法、超临界CO2萃取法(SFE)等。这些方法在诸多工业领域中应用，属于通用技术。

3.4 化学法制备生物柴油

目前，生物柴油的制备方法主要有化学法、物理法、生物酶法三类，以化学酯交换法研究最为广泛。该法是采用脂肪酸甘油酯和甲醇在催化剂的催化下进行酯交换反应，产生脂肪酸甲酯和甘油。

3.4.1 均相催化酯交换 通过加入盐酸、硫酸、磷酸，或NaOH、KOH等均相酸或碱催化剂，使催化反应高效进行。与均相酸催化法相比，碱催化更快，约为酸催化剂4 000倍，但碱会与游离的脂肪酸发生皂化反应，发生乳化，使得催化剂不易去除，水又会促进甲酯的水解。均相酸催化法虽受游离脂肪酸影响小，但耗时较长，对设备有一定腐蚀，且耗用甲醇量较多，当体系中水和游离脂肪酸含量较高时，可考虑选择酸催化剂催化[25]。

3.4.2 多相催化酯交换 多相催化法最大的优点在于大大方便了催化剂的分离，有利于去除游离脂肪酸杂质[26]。采用的催化剂常有硫酸化金属氧化物、磺酸离子交换树脂、磺酸改性介孔二氧化硅、磺化碳基催化剂等[27]，并且具有对设备腐蚀性小、环境污染小的优点。但反应速率较慢，主要是因为醇和油两相不互溶，阻碍了反应的进行。夏禹杰等[28]使用双醚类物质作为共溶剂，使甘油三酸酯和低级醇形成均相反应体系，从而增大了反应界面，加快了反应速度。

3.4.3 亚临界酯交换法 在温度接近甲醇超临界温度下，催化酯交换反应，在一定程度上弥补了均相、多相催化酯交换和超临界酯交换的缺陷。该方法使用固体催化剂，使后续的催化剂分离更加容易；在亚临界状态下甲醇和油脂的互溶度增加，提高了反应速度；对原料的含水量、酸值要求不高，降低了预处理等成本；解决了高温高压问题，对设备的要求降低[29]。

3.4.4 超临界酯交换法 甲醇在超临界状态下与油脂的互溶度极大增加，甲醇既是反应物又是催化剂，使分离更加简单；反应对油脂要求低，使预处理简单。此外，甲基酯的转化率高，并且对环境污染小。主要的缺点为反应是在高温高压下进行，对设备条件要求高，使大规模应用受阻。Kusdiana等[30]提出超临界流体二步法，即水解、酯化二步法合成生物柴油的工艺。首先将油脂在亚临界状态下水中水解成脂肪酸，脂肪酸在超临界甲醇条件下发生甲酯化反应生成脂肪酸甲酯。此法的脂肪酸与甲醇发生酯化的温度压力条件更温和，但工艺流程变得相对复杂，目前研究还不够深入，在未来此种改进方法可能会有很好的应用[31]。

4 结束语

开发绿色替代能源已经成为发展趋势。微生物油脂以其独特的优点很可能成为生物柴油的重要原料来源，然而以微生物油脂为原料的第三代生物柴油技术还未成熟，原因在于生产成本较高、不能高效规模化生产采集油脂。未来可从以下几方面进行研究：

(1)寻求更加廉价而高效的原料用于产油微生物发酵。

(2)继续深入研究产油微生物的筛选、改良和培育，最好能结合处理有机废弃资源，创造更加经济环保的生产方式。

(3)对微生物油脂合成代谢网络继续深入分析，找到关键因素，在提高油脂产量上，找到新突破口。

(4)优化工艺，探求可廉价高效提取微生物油脂的新方法。