纤维素在固定化酶的研究进展

2023-01-16徐效熊艳舒黄可榆谢彩锋杭方学陆海勤李凯

应用化工 2022年1期

徐效，熊艳舒，黄可榆，谢彩锋，2，3，4，杭方学，2，3，4，陆海勤，3，4，李凯，2，3，4

(1.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004；2.糖业及综合利用教育部工程研究中心，广西南宁 530004；3.蔗糖产业省部共建协同创新中心，广西南宁 530004；4.广西绿色制糖工程技术研究中心，广西南宁 530004)

酶作为一种生物催化剂，可在不改变化学平衡情况下提高反应速度，具有生物相容性、生物降解性[1]。近年来，酶因具有高效率、特异性强、反应条件温和低能耗等优点，已被广泛应用于基础研究[2]和工业生产(食品、制药、化妆品、纺织、造纸等多个领域[3-7])。随着生物技术发展，酶在工业生产中占据地位日益重要，但稳定性差、回收率低、成本高及产量小等难题始终限制着游离酶在工业中大规模应用，为此，酶固定化技术应运而生。

酶固定化技术最早出现于1916年[8]。酶固定化技术是指选择适当的固定化方法将游离酶固定在便于回收的载体上的一种生物技术，能够使酶重复使用延长酶使用寿命，提高酶稳定性，进而明显降低生产成本，显著拓宽了酶应用领域。近几十年来，固定化材料和酶工程领域的发展得到学者与生产企业广泛关注，取得长足进步。目前酶的固定化方法主要通过物理(吸附、包埋)和化学相互作用(交联、共价键)来实现，载体表面结构、疏水/亲水性、物理化学稳定性、活性基团等特性及适合于不同酶制剂的固定化技术的选择会影响固定化酶的强度和稳定性。因此，良好的固定化酶载体和先进的固定化酶技术是提高固定化酶品质的关键[9]。

纤维素是地球上最丰富的天然聚合物之一，广泛存在自然界植物中，也可由藻类、被囊动物或特定细菌合成[10]。纤维素因其表面具有丰富的羟基等活性基团，能够很好地与酶结合，因此可作为一种新型的固定化酶载体；另外因为纤维素材料来源丰富，可再生，成本低，并具有良好的生物降解性[11]，作为酶固定化材料应用具有广泛发展前景。

1 酶的固定化载体

在工业生产中，大多数酶源自微生物，生物技术的发展使得酶在精细化学、食品、塑料、化妆品、药物和生物燃料等领域应用已逐渐走向商业化[12-13]。游离酶虽然反应条件温和，能够提高反应效率，但是由于其在实际应用过程中不易从反应介质中分离影响产品品质，导致工业生产成本过高，严重限制其商业化应用。而固定化酶技术不仅能够延长酶使用寿命，还可以降低酶的使用成本，为工业酶的研究打开了一条新路径。在固定化酶技术中，固定化载体的研究至关重要。固定化酶载体本身的稳定性和机械强度会影响酶的可回收性，另外，载体的比表面积大小、多孔结构以及表面活性官能团与酶的负载量有着密切联系。因此，固定化酶载体对最终形成固定化酶物化特性影响重大。固定化酶载体主要分为无机载体、合成聚合物载体及天然聚合物载体[14-17]。

1.1 无机载体

目前，用于固定化酶的无机载体材料主要包括二氧化硅、多孔玻璃、氧化铝、硅藻土等[18]，二氧化硅材料因其比表面积和孔径可控、制备简单最受关注。典型的二氧化硅载体主要有介孔二氧化硅、硅胶、泡状和气相二氧化硅[19]，其中介孔二氧化硅载体固定化酶应用最广泛[20]。

1.2 合成聚合物载体

合成聚合物载体具有多种化学基团和机械形态，可以根据酶的特性进行组合加工。常见的合成聚合物载体包括聚氯乙烯、聚氨酯微粒、聚乙烯醇和聚苯胺等[21]。环氧甲基丙烯酸酯作为一种工业生产常见环氧活化树脂，具有良好机械强度，使用该材料固定酶可用于搅拌槽或流化床反应器[22]。

1.3 天然聚合物载体

天然聚合物载体是指从自然界获得的聚合物，具有无毒、可生物降解、可再生等特性[23]。大多数无机及合成聚合物因可降解性差，易对环境造成污染，在倡导绿色环保的今天，天然聚合物作为固定化酶载体越来越备受关注。如今用于酶固定化天然聚合物载体主要有海藻酸钠、壳聚糖、琼脂糖、纤维素等。海藻酸钠和壳聚糖是酶包埋中最常用的载体，酶的包埋率可以达到90%以上，且在不同pH及温度条件下具有良好稳定性；但这两种载体其孔径大小较难控制，酶与底物不易接触使反应不充分；另外，这两类载体机械强度较小，在实际应用过程中载体容易破碎，使酶泄露出来[24-25]。琼脂糖具有亲水性、孔隙率高、机械强度大以及稳定性好等特点，用其来对酶进行固定，每克湿载体负载量最高可以达到100 mg；但琼脂糖作为固定化酶的载体材料成本过高，不适合工业化推广[26]。纤维素载体比表面积大、机械强度高的特性使酶能够更多地附着其表面与底物充分接触、多次重复使用，而且该载体材料来源广泛可再生是现如今研究领域关注的重点，纤维素作为固定化酶的载体材料是很有发展潜力的。

2 纤维素载体的研究

纤维素固定化载体根据来源不同可分为木质纤维素载体与细菌纤维素载体。纤维素载体不仅活性基团多，而且还具有机械强度大、对酶温和等特点[27]，同时更容易从环境中获取，价格低廉。但在特定条件下纤维素表面羟基呈弱疏水性，其在某些领域工业应用受到限制，因此有研究者通过将纤维素表面羟基羧甲基化、乙酰化和硅烷化改性，开发出功能化纤维素载体[28]，或将纤维素与其他新型材料复合，以改善纤维素固定化载体性能，拓展其应用范围。

2.1 木质纤维素载体

木质纤维素载体主要来源于木本植物、草类、农业废弃物，这些原料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，不同原料各组分比例有所不同[29]。由于木质纤维素通常被半纤维素和木质素紧密包裹，一般采用碱法化学制浆、漂白、酶解和TEMPO氧化等工艺对木质纤维素原料进行预处理，通过溶解木质素和半纤维素来分离出纤维素，并制备木质纤维素载体[30]。同时，经分离提纯处理后，纤维素载体表面会暴露更多的活性基团，可以与酶更好结合，因此固定化效果更好。Bezerra等[31]将椰子皮经碱法预处理获得纤维素，通过乙二醛交联固定化漆酶，固定化酶可保留初始活性的59%左右，热稳定性也有所提高。然而，使用木质纤维素作为固定化酶载体存在着纤维素提纯效率低、操作过程复杂等弊端。

近年来，以农业生产中的木质纤维素原料为载体的酶固定化技术已成为国内外研究热点。Priyanka等[32]以椰子纤维为载体交联固定化漆酶，提高了漆酶稳定性同时将酶的相对酶活提高至80%；Nuraliyah等[33]利用戊二醛(GA)使玉米壳纤维素交联固定化脂肪酶，提高脂肪酶操作稳定性；另外，通过对木质纤维素进行功能化改性可提高固定化酶稳定性，使固定化酶能够重复多次使用以降低成本。Luo等[34]通过环氧氯丙烷的氯基团和纤维素的羟基之间的亲核反应将环氧基团引入纤维素，然后将青霉素G酰化酶(PGA)附着在环氧氯丙烷活化的纤维素微球上，固定化PGA表现出高效的催化活性以及热稳定性。Cespugli等[35]通过高碘酸盐氧化改性稻壳纤维素使其具有官能化醛基，用于固定化脂肪酶，与未经氧化改性的载体相比，改性后的酶负载量可提高至58%。陈辉等[36]在离子液体中用L-丝氨酸对提取菠萝皮渣纤维素进行均相改性，并用于固定化菠萝蛋白酶，与游离酶相比，固定化菠萝蛋白酶具有更优的温度及酸环境稳定性。研究与实践表明，木质纤维素材料作为固定化酶载体有许多优势：较大的比表面积可以提高酶负载量；材料表面的多孔结构可使酶的构象不易受损；纤维素表面丰富的活性基团可以通过离子交换、表面吸附、配位、络合等复杂机理与酶相连接。这些优势极大提高了载体负载酶的稳定性从而使固定化酶在反应介质中循环多次使用。

2.2 细菌纤维素载体

细菌纤维素(BC)是一种仅由葡萄糖单元和水组成生物材料，可以由微生物细胞在纳米尺度上合成[37]。BC不含有木质素和半纤维素等杂质，结晶度更高，是以高纯度的形式生产，不需要复杂繁琐的预处理过程[38]。

相对于木质纤维素，BC具有高结晶度和高含水量的特点，热稳定性更高；另外 BC还具有纳米孔结构、比表面积大、游离羟基多等优点，因此BC被认为是新型的固定化酶载体。吴月红等[39]采用细菌纤维素(BC)膜来固定化漆酶后，与游离酶相比，固定化漆酶对活性艳蓝KN-R脱色率提高了2倍，反应速率提高了3倍。Dikshit等[40]利用木糖杆菌从生物柴油的粗甘油中生产细菌纤维素(BC)并固定化脂肪酶，该固定化酶在不同温度下都具有较高的活性、pH范围更广泛，与游离脂肪酶相比，BC固定化脂肪酶具有较好稳定性和生物活性，可用于工业生产。Yu等[41]用APTES对BC进行了硅烷衍生物改性制备氨基官能化细菌纤维素，并用该载体固定辣根过氧化物酶(HRP)，相对活性为90%，高于游离酶，且经过10个反应周期相对酶活仍保持在70%以上。

2.3 纤维素复合材料

单一纤维素材料作为固定化酶载体存在不足，在工业生产过程中稳定性不高且不易与反应物分离，传统分离技术(离心或纳滤)会增加回收成本，为解决这些问题，科研工作者们对纤维素复合材料进行了重点研究。

Dai等[42]将菠萝皮羧甲基纤维素、聚乙烯醇及介孔二氧化硅SBA-15水凝胶制成的复合材料用于固定化木瓜蛋白酶，与采用单一菠萝皮羧甲基纤维素固定化木瓜蛋白酶相比，多种材料的复合使载体为酶提供了更多的附着位点，提高了酶的负载量，并且在80 ℃孵育2 h后，固定化木瓜蛋白酶活性保留56%，游离木瓜蛋白酶活性仅保留16%。储存10 d后，固定化木瓜蛋白酶的初始活性保留79%，而游离木瓜蛋白酶的初始活性仅保留27%，固定化木瓜蛋白酶的热稳定性和贮存稳定性均有所提高。

另外，磁性材料作为固定化酶载体具有潜在应用前景，将其与纤维素一起制备复合材料可以解决工业生产中分离成本过高问题。Drozd等[43]将细菌纤维素(从木糖科杆菌中获得)氧化接枝聚乙烯亚胺，将与Fe2+和Fe3+混合合成的磁性细菌纤维素复合材料用于固定化脂肪酶，该固定化酶重复使用10次后相对酶活可达到65%，可通过外界磁场迅速将酶与反应介质分离。Suo等[44]制备了离子液体修饰的磁性羧甲基纤维素纳米材料，并将其作为载体进行脂肪酶的固定化，其活性分别比游离脂肪酶和经羧甲基纤维素纳米材料固定的脂肪酶高1.43倍和2.81倍，酶的稳定性提高显著。经研究发现，磁性纤维素复合材料是一种固定化酶多功能载体，既具有磁性材料特性(如高比表面积及易分离)，又可与纤维素复合进行化学改性添加活性基团，更加适用于各式各样工业生产环境。