胶原三肽的酶法制备工艺研究

汪雪莲，刘鹏展，崔春*, 刘国锋

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院,广州 510640; 2.湖南菲勒生物技术有限公司，长沙 410205)

鱼皮胶原蛋白属于Ⅰ型胶原蛋白,Ⅰ型胶原蛋白是由1条α1链(G9M6I5)和2条α2链(G9M6I6)三螺旋组成。每条肽链的序列特征为Gly-X-Y 的重复序列,X主要为脯氨酸(Pro),Y一般为羟脯氨酸(Hyp)和丙氨酸(Ala)[1]。

胶原蛋白水解产物被报道具有多种生理活性,其中以胶原三肽GPH[2]、GPA[3]、GHK[4]活性最为突出。GPH 具有易吸收、低过敏性、预防疾病等优点,Sontakke等[5]研究发现GPH 能跨肠单层细胞进行转运进入血浆并在人体内稳定运输,有利于机体吸收;Kim等[6]用含34 mg/kg GPH 的胶原蛋白水解物处理经丙酮诱导后皮肤干燥的小鼠,发现GPH 可以有效地维持胶原结构形态以及预防皮肤干燥;满帅[7]报道 200 μg/mL的GPH可有效防治大鼠地塞米松性骨质疏松;Deng等[8]研究发现200 mg/kg 的GPA可通过降低氧化应激保护肠道损伤;艾丽奇报道GPA 有潜在的抗光老化作用,100 μmol/L GPA 处理光损伤成纤维细胞,细胞存活率为75.34%，此外，GPA还可抑制胶原酶的产生、抑制Ca2+离子内流和改善线粒体膜电位流失。

胶原三肽具有以上生理活性,所以被广泛应用于美容、保健食品行业。初鑫等[9]研究了鳕鱼皮胶原蛋白肽果汁饮料可有效预防和延缓皮肤光老化;金辰也等[10]制备了含有苹果汁、胶原三肽的美容饮料,可以防止皮肤干燥，增加皮肤光滑度。同时胶原三肽也可以促进愈伤组织、骨骼修复、矿物质吸收,使其能够作为食品营养补充剂或强化剂,通过口服来调节人体机能。Tang等[11]研究发现胶原三肽可以有效抑制动脉粥样硬化,所以将其应用于功能食品中可以预防多种疾病以及辅助治疗某些疾病。

胶原蛋白肽的酶解工艺一般以内切蛋白酶水解为主,水解产物分子量较大,肽的种类多样,几乎不含有GPH、GPA 等三肽。鉴于此,本文优化了内切蛋白酶与实验室筛选得到的三肽基肽酶(解淀粉芽孢杆菌蛋白酶)分步水解罗非鱼鱼皮胶原蛋白,并对酶解产物中胶原三肽进行了定性和定量分析,以期为胶原三肽的工业化制备提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼鱼皮:汕尾市五丰海洋生物科技有限公司;碱性蛋白酶(Alcalase)、胰蛋白酶(Trypsin)、复合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase):诺维信生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(Papain):南宁东恒华道生物科技有限责任公司;胶原三肽Gly-Pro-Hyp(GPH)、无水乙醇、甲醛、盐酸、氢氧化钠:均为分析纯。

从中国南海海泥中筛选出的解淀粉芽孢杆菌SWJS22(BacillusamyloliquefaciensSWJS22,CGMCC No.8425),由华南理工大学轻工与食品学院食品生物技术实验室提供。将解淀粉芽孢杆菌接种于含有1%罗非鱼鱼皮和0.5%麸皮的液体培养基的三角瓶中,在30 ℃、180 r/min条件下培养48 h后, 过滤得到的上清液作为粗酶液。

1.2 仪器与设备

FA2204B精密电子天平 上海精密科学仪器有限公司;SCIENTZ-18N 冷冻干燥机 浙江赛德仪器设备有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 江阴市保利科研器械有限公司;HYP-308消化炉、KDN-103F自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司;DZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;TS100微型旋涡混合仪 杭州瑞诚仪器有限公司;U-3000液相色谱仪 Thermo Fisher Scientific有限公司;Agilent 1290超高效液相色谱-质谱仪 Bruker科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鱼皮胶原蛋白内切蛋白酶酶解条件优化

罗非鱼鱼皮与水等重量混合,加热至110 ℃保持30 min,使鱼皮胶原蛋白解聚后[12],加入罗非鱼鱼皮重量0.25%的商品化酶制剂(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶),55 ℃酶解3.5 h后取出于100 ℃沸水中灭酶15 min。测定蛋白质的回收率和水解度。鱼皮胶原蛋白肽蛋白质含量的测定参考凯氏定氮法。

鱼皮胶原蛋白肽水解度的测定采用甲醛滴定法,计算公式如下:

采用凯氏定氮法(Kjeldahl nitrogen)测定鱼皮胶原蛋白肽与酶解上清液中的总氮,计算公式如下[13]:

式中：m上清液指酶解上清液的质量,N上清液指酶解上清液的含氮量,my指加入鱼皮胶原蛋白的质量,Ny指鱼皮胶原蛋白的含氮量。

1.3.2 解淀粉芽孢杆菌蛋白酶酶解工艺优化

分别以罗非鱼鱼皮内切蛋白酶(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶)酶解产物为底物,添加液体质量5%的解淀粉芽孢杆菌粗酶液,55 ℃水解不同时间后取出于100 ℃沸水中灭酶15 min,得到鱼皮胶原蛋白肽,测定其水解度变化。

1.3.3 鱼皮胶原蛋白肽分子量分布情况

采用HPLC法测定鱼皮胶原蛋白肽的分子量分布;分别配制相关酶处理的蛋白肽溶液5 mg/mL,过0.22 μm 膜处理,采用TSKgel G2000 SWXL进行液相测定。以含有0.1% TFA 的乙腈(60%)为流动相,流速为0.8 mL/min,等度洗脱进行分析。以标准品分子量对数与洗脱时间做回归方程,计算各样品的肽分子量分布[14]。

1.3.4 鱼皮胶原蛋白肽的半定量检测

将胶原蛋白酶解产物灭酶、浓缩、冷冻干燥后收集其粉末,取0.1 g样品在10 mL 流动相中溶解,经0.45 μm 过滤器过滤,上机分析。

1.3.4.1 高效液相色谱分析

色谱柱:Jupiter 4u Proteo 90A;流动相:A为0.1%三氟乙酸,B为乙腈∶甲醇为1∶4;检测器:UV 214 nm;流速:0.3 mL/min;洗脱时间:50 min;等度洗脱 (A∶B为95∶5);进样量:10 μL。

1.3.4.2 液质联用分析胶原蛋白肽

使用UPLC-MS/MS鉴定胶原蛋白肽,具体实验操作:色谱流动相经分流阀分流后进入质谱,分流比控制在9∶1(10% 进入质谱)。将柱子连接到HPLC上,在柱温 40 ℃时,UV 检测器(214 nm)条件下,流速0.3 mL/min对色谱柱进行约1 h的稳定化处理,在稳定化处理之后,进样量10 μL条件下分析标准品和样品,用面积标准化计算含量。

1.3.5 鱼皮胶原蛋白肽中GPH 的检测

以商品化GPH(纯度为99%)为标准样品,做标准曲线。在214 nm处,采用HPLC法测定鱼皮胶原蛋白酶解产物中GPH 的含量。

1.4 数据处理

重复实验3次,结果以“平均值±标准差”的形式表示,采用Excel 2016和Origin 2021软件进行图表绘制和方差分析。数据之间的显著性差异定义为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 鱼皮胶原蛋白的蛋白酶的筛选

图1 鱼皮胶原蛋白的蛋白质回收率(a)、水解度(b)的变化Fig.1 Changes of protein recovery rate (a) and hydrolysis degree (b) of fish skin collagen

使用不同蛋白酶对罗非鱼鱼皮胶原蛋白进行酶解处理,由于不同酶的酶切位点不同,其水解产物的蛋白回收率和水解度会存在差异[15]。鱼皮胶原蛋白的蛋白质回收率和水解度高低顺序均为中性蛋白酶<碱性蛋白酶<复合蛋白酶<木瓜蛋白酶<胰蛋白酶。胰蛋白酶的酶解效率最高,蛋白质回收率达到90.71%,水解度为12.16%,显著高于其他蛋白酶,归因于胰蛋白酶在鱼皮胶原蛋白中酶切位点较多,使得其蛋白质回收率和水解度偏大。木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解产物的蛋白回收率和水解度分别为88.59%和9.45%,87.59%和7.5%。中性蛋白酶的蛋白质回收率仅为84.79%,水解度为5.74%,这可能是中性蛋白酶在鱼皮胶原蛋白中的酶切位点较少,使得其酶解肽段较大。

酶解产物感官评价表明，胰蛋白酶酶解产物苦味最重,木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶仅有微弱的苦味,中性蛋白酶和复合蛋白酶几乎无苦味。一般而言，酶解产物的苦味与肽分子量、肽的疏水性以及一级结构有关[16]。综合考虑酶解效率和感官评价,选择木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进一步进行酶解处理。

2.2 解淀粉芽孢杆菌蛋白酶二次水解鱼皮胶原蛋白肽

图2 双酶分步水解作用对鱼皮胶原蛋白肽水解度的变化Fig.2 Changes of hydrolysis degree of fish skin collagen peptide by stepwise dual-enzyme hydrolysis

随着酶解时间的增加,双酶分步水解使得鱼皮胶原蛋白水解度总体呈现上升的趋势,可能是单一蛋白酶的酶切位点有限,双酶分步水解作用可以达到协同增效的效果[17]。

解淀粉芽孢杆菌蛋白酶在碱性蛋白酶酶解的基础上进一步酶解6 h后鱼皮胶原蛋白肽水解度为14.78%,酶解12 h后鱼皮胶原蛋白肽水解度为18.40%,酶解15 h后水解度为18.80%,但酶解12 h和酶解15 h之间没有显著性差异。综合考虑能耗与效率,选择酶解处理12 h得到的鱼皮胶原蛋白肽进行进一步研究;解淀粉芽孢杆菌蛋白酶在木瓜蛋白酶酶解的基础上进一步酶解12 h后水解度为14.64%,酶解效果显著低于解淀粉芽孢杆菌蛋白酶与碱性蛋白酶分步酶解组合。

2.3 鱼皮胶原蛋白分子量分布测定

鱼皮胶原蛋白肽分子量分布见图3。

图3 鱼皮胶原蛋白肽分子量分布Fig.3 The molecular weight distribution of fish skin collagen peptide注:解淀粉芽孢杆菌蛋白酶(Bacillus amyloliquefaciens protease)简称 Baq Pro。

由图3可知,经单一酶处理后再经解淀粉芽孢杆菌蛋白酶二次酶解处理,多数胶原蛋白肽被水解成小分子肽段,主要是<1 kDa的肽段,其含量为碱性蛋白酶+解淀粉芽孢杆菌蛋白酶(86.61%)>木瓜蛋白酶+解淀粉芽孢杆菌蛋白酶(80.40%)>碱性蛋白酶(63.00%)>木瓜蛋白酶(59.13%);其中解淀粉芽孢杆菌蛋白酶在碱性蛋白酶酶解的基础上进一步酶解后酶解液中>2 kDa的肽段含量极低，为2.28%,其在木瓜蛋白酶酶解的基础上进一步酶解后酶解液中>2 kDa的肽段含量为10.30%,说明经碱性蛋白酶酶解后再经解淀粉芽孢杆菌蛋白酶处理得到的鱼皮胶原蛋白肽分子量极小,胶原蛋白几乎全部水解成小分子肽段(二肽、三肽等),其酶解产物小分子肽段的存在也预示着酶解产物具有较高的生物活性,小分子肽段也便于人体利用吸收[18]。

2.4 UPLC/MS/MS半定量分析胶原蛋白肽中胶原三肽的种类

将上述碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶与解淀粉芽孢杆菌蛋白酶分步水解得到的两种鱼皮胶原蛋白肽，经灭酶、过滤、浓缩和冷冻干燥后,得鱼皮胶原蛋白肽粉。两种鱼皮胶原蛋白肽粉均为白色粉末,在5%和10%浓度下无明显苦味和异味，表明采用解淀粉芽孢杆菌蛋白酶对内切蛋白酶的水解产物有一定的脱苦效果。采用UPLC-MS/MS对上述两组酶解产物进行半定量分析,以比较不同蛋白酶组合对胶原蛋白肽种类和含量的影响,结果见表1。

表1 UPLC-MS/MS鉴定结果Table 1 The identification results of UPLC-MS/MS

由表1可知,酶解产物中鉴定出多种胶原三肽,包括GPH、GPA、HAG、LPG、GPV、PGR、GPT 等,其中以GPA、GPH 和HAG 的离子强度最大。从离子强度来看,碱性蛋白酶+解淀粉芽孢杆菌蛋白酶分步水解后酶解产物中GPA 和GPH 的离子强度明显高于木瓜蛋白酶+解淀粉芽孢杆菌蛋白酶组合。周先艳[19]研究发现经碱性蛋白酶酶解鳕鱼皮胶原蛋白,其酶解液中GPA、GPS、GPR肽段含量较多;同样艾丽奇用碱性蛋白酶处理后也得到GPA肽段,并验证了GPA具有潜在抗光老化的活性;Kim 研究发现70 μg/mL GPH作用人体真皮成纤维细胞可以有效促进透明质酸,减少水分流失以及促进I型胶原蛋白的合成;Wang等[20]从猪、牛、罗非鱼、母鸡表皮经木瓜蛋白酶酶解制备的胶原蛋白水解物中鉴定出了Gly-Pro-Hyp肽段,并且可减轻经 UVA 诱导的人体真皮成纤维细胞损伤。

目前考虑到GPH能改善皮肤以及具有多种生物活性已有多篇文献报道,故采用HPLC法对碱性蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌蛋白酶分步酶解产物中GPH含量进行测定,结果表明酶解产物中GPH 含量达到1.46%。

3 结论

鱼皮胶原蛋白经胰蛋白酶酶解后其水解度最高，为12.16%,但酶解液苦味明显,影响产品的风味以及口感，所以选用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶作为酶解的酶制剂。

碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物为底物,添加解淀粉芽孢杆菌蛋白酶于55 ℃水解12 h后,其水解度分别从7.50%和9.45%增加到18.40%和14.64%。分子量分布测定显示，酶解产物中<500 Da的肽段占比分别为54.28%和48.90%。

经UPLC-MS/MS分析鉴定得到经碱性蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌蛋白酶分步水解处理后,酶解液中的特征性肽段主要是GPA、GPH、HAG 等,用HPLC法测定GPH 含量得出分步水解后酶解产物中GPH 含量达到1.46%。

本研究通过一系列酶解条件探索,最终得到了富含GPA、GPH 等小分子胶原三肽的酶解混合物,并且其酶解产物的口感、风味较佳(轻微苦味)。为进一步提高胶原蛋白附加值提供了数据支撑,也为后期胶原蛋白作为功能性食品原料以及食品营养与美容添加剂奠定了基础,同时促进了胶原蛋白的再次利用。