佛罗里达文昌鱼的繁殖频次研究

张 翔，张秋金

(福建师范大学生命科学学院， 福建 福州 350117)

文昌鱼隶属于脊索动物门头索动物亚门，因其在动物进化上占据重要地位，可以作为研究脊椎动物起源与演化的模式生物[1]，而且文昌鱼具有丰富的营养成分，尤其是4种鲜味氨基酸和不饱和脂肪酸含量较高[2]，是一种优良的水产养殖对象。中国厦门同安刘五店曾盛产文昌鱼，形成世界上唯一一个文昌鱼渔场，当地渔民抓捕文昌鱼历史悠久[3]，但是由于栖息环境遭受破坏，文昌鱼种群数量严重下降[4]，已被列为国家二级重点保护动物。不论是作为模式生物的科研价值还是作为珍稀物种的保护或珍稀水产养殖对象的开发，都有必要深入研究文昌鱼的繁殖规律。关于文昌鱼的繁殖生物学已有不少报道[5-10]，但是迄今为止文昌鱼在个体水平上一年可以繁殖几次仍然不清楚[5]，因为文昌鱼是潜居在浅海沙滩，繁殖季节天黑以后，雄雌文昌鱼先后从沙中闯出，排精排卵，卵子在海水中受精，难以观察海区文昌鱼的繁殖。随着实验室饲养繁育文昌鱼技术的突破[11-12]，可以在实验室条件下观察文昌鱼的繁殖，本研究以实验室饲养繁育的佛罗里达文昌鱼Branchiostomafloridae作为研究对象，连续3年观察其每年的繁殖次数，发现佛罗里达文昌鱼繁殖力较强，作为人工养殖对象具有明显优势。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验用文昌鱼是实验室科研引进后人工饲养繁育的子三代佛罗里达文昌鱼。试验开始时，文昌鱼处于二龄期(第1年繁育出来的文昌鱼，到第2年定义为一龄期，第3年定义为二龄期，以此类推)，挑选性腺发育饱满的10雌(♀)10雄10(♂)，编号依次为♀1～♀10、♂1～♂10。本试验连续观测了3年直至四龄期结束，在试验过程中，有文昌鱼发生意外或自然死亡，二龄期结束、三龄期开始繁殖前剩余8雌8雄；三龄期结束、四龄期开始繁殖前只剩下5雌7雄。为了确保不因种群变小而可能影响被研究对象的正常产卵/排精，四龄期开始繁殖前，另外随机挑选6雌5雄，共同饲养在同一个容器内，但新增个体的数据不列入试验对象的统计分析范围。

1.2 试验方法

在体视显微镜下对佛罗里达文昌鱼逐尾观察，测量体长、计数身体左右侧性腺数目，观察喙鳍和臀前鳍鳍室的细微差别，对不同个体进行辨识。然后将文昌鱼一起饲养在透明方形塑料桶(规格32 cm×22 cm×19 cm)中，桶底垫以适合文昌鱼潜居的海沙厚度5 cm左右，加入经沙滤处理的天然海水，高出沙面5～10 cm，连续充气，置于人工控制光照周期和温度的室内，设置14 h光照和10 h黑暗的光照周期(14 L∶10 D)，全年温度20℃～30℃。每天早晨和傍晚定时定量投喂以等鞭金藻Isochrysiszhanjiangensis和角毛藻Chaetocerosmuelleri为主的混合单细胞藻类。文昌鱼的日常饲养管理根据之前的报道进行[11-12]。在产卵季节，每天用尼龙捞网在饲养容器内捞检，确定是否产卵，若发现产卵，则收集受精卵，记录产卵日期。

不定期观测每1尾文昌鱼的性腺发育状态，观测临近产卵期和刚产卵后的性腺状态。在体视显微镜下观察性腺的发育期、测量性腺直径。性腺的发育期分为未发育期、Ⅰ期(增殖期)、Ⅱ期(小生长期)、Ⅲ期(大生长期)、Ⅳ期(生长后期)、Ⅴ期(成熟期)和产后等7个阶段[13]。性腺的直径是指沿文昌鱼身体背腹轴方向上性腺的长度，佛罗里达文昌鱼身体两侧各有20余个性腺，测量其身体左侧前中段最大的性腺直径，拍照时视野的左侧从文昌鱼身体左侧第4个性腺开始。

在统计分析每年文昌鱼产卵/排精时，凡是当年繁殖季节中途死亡的个体不参与本年度平均值计算，另外终生不排精的♂10也不参与统计。

2 结果与分析

2.1 佛罗里达文昌鱼不同个体的识别

当多尾文昌鱼饲养在同一个容器，首先需要对不同个体进行辨认，佛罗里达文昌鱼不同个体之间在外形上都有容易辨认的细微差别，根据性别、体长以及在体视显微镜下观察喙鳍的形状、臀前鳍内多个鳍室的形态及位置关系等特征可以准确对佛罗里达文昌鱼进行个体辨认。由图1可知，佛罗里达文昌鱼不同个体(♀5、♀7、♀8、♂1、♂6、♂7)的喙鳍和臀前鳍鳍室有明显的细微差别，能很好地对不同个体进行辨识。

注：正方形虚线框显示喙鳍的形状，长方形虚线框显示臀前鳍内多个鳍室的形态；标尺1 mm。图1 佛罗里达文昌鱼不同个体形态上的细微差异Fig.1 Subtle differences in the morphology of different individuals of Branchiostoma floridae

2.2 佛罗里达文昌鱼个体的性腺发育变化

佛罗里达文昌鱼在一个繁殖周年里，4月份开始产卵可持续到12月份。期间性腺可以重复发育成熟，多次繁殖。雌性第5号(♀5)和雄性第7号(♂7)在三龄期的性腺直径变化见图2，♀5和♂7三龄期不同时间性腺外观的变化见图3。♀5在三龄期当年4月16日卵巢已经发育成熟，处于Ⅴ期，呈淡黄白色、非常饱满，卵巢与卵巢之间紧密排列，几乎没有缝隙，卵巢内卵子排列也很紧密(图2A)。4月19日发生第1次产卵，产卵量大，4月22日的卵巢显著缩小，卵巢中还有不少未成熟卵子，呈Ⅲ期形态，卵子之间的排列松散(图2B)。随后卵巢重新发育，5月19日的卵巢再次发育成熟，很饱满、处于Ⅴ期(图2C)。5月24日发生第2次产卵(与第1次产卵间隔35 d)，5月27日可见卵巢缩小，但残留的未成熟卵子还比较多(图2D)。产卵后卵巢继续发育，6月18日卵巢第3次成熟(图2E)。6月26日第3次产卵(间隔33 d)，产卵后卵巢变小，呈Ⅳ期(图2F)。之后卵巢继续发育，7月23日处于Ⅴ期(图2G)，间隔较长时间后于8月17日第4次产卵(间隔52 d)，但产卵量较少，8月23日卵巢还比较饱满(图2H)，之后卵巢还是继续发育，9月4日卵巢更饱满(图2I)。9月6日第5次产卵(间隔20 d)，而且产卵量较多，卵巢直径变小，9月14日可见卵巢内残余的未成熟卵子间隙比较明显(图2J)；从9月到10月卵巢继续发育，但是发育速度缓慢，直到10月25日卵巢再次发育成熟，很饱满，为Ⅴ期(图2K)。10月30日发生第6次产卵(间隔54 d)，产卵量较大，10月31日卵巢变小，残留的未成熟卵子较少(图2L)；但是随着卵巢的再次发育，11月26日再一次成熟，为Ⅴ期(图2M)，然后12月3日第7次产卵(间隔34 d)，产卵量适中，12月8日卵巢变小，里面还有不少卵子(图2N)，之后当年未见♀5再产卵，直到三龄期繁殖周年结束，♀5一共产卵7次。

图2 三龄期♀5和♂7佛罗里达文昌鱼性腺直径的变化Fig.2 Changes of the gonadal diameter of Branchiostoma floridae with female 5 and male 7 at the third instar

注：左侧2列、大写字母A～N表示♀5号，右侧2列、小写字母a～n表示♂7，括号内的数字表示月份和日期。黑色粗剪头指示左侧第7个卵巢，白色细箭头指示左侧第7个精巢；标尺1 mm。图3 三龄期♀5和♂7佛罗里达文昌鱼性腺外观的变化Fig.3 Changes of the gonadal appearance of Branchiostoma floridae with female 5 and male 7 at the third instar

♂7在三龄期当年4月16日时精巢已经发育成熟，处于Ⅴ期，呈白色均质状、很饱满(图2a)。4月19日第1次排精后，4月22日的精巢显著变薄变小，精巢中还有不少精子，呈不均匀云雾状(图2b)。第1次排精后精巢随即重新发育，5月19日的精巢再次发育成熟，处于Ⅴ期，非常饱满(图2c)。5月24日发生第2次排精(间隔35 d)，5月27日的精巢明显皱缩变小(图2d)。第2次排精后精巢继续发育，6月18日时精巢发育成熟为Ⅴ期(图2e)。6月26日发生第3次排精(间隔33 d)，7月1日精巢变小(图2f)，这次排精后精巢发育比较缓慢，经历近1个月，到7月23日时精巢发育，但不是很饱满，处于Ⅳ期(图2g)。之后继续发育，间隔较长时间后于8月17日发生第4次排精(间隔52 d)，排精量较少，8月23日精巢变小(图2h)。重新发育后至9月4日精巢又发育成熟，但较小(图2i)；9月6日第5次排精(间隔20 d)，排精量较少，9月14日的精巢变小，较8月23日的精巢稍大一点(图2j)。经历较长时间的发育后，到10月25日精巢发育更加饱满(图2k)，10月30日发生第6次排精(间隔54 d)，10月31日精巢缩小(图2l)，之后精巢缓慢恢复，于11月26日精巢稍有增大(图2m)，但12月8日后，未见明显变化(图2n)，直到当年繁殖季节结束，未见其再排精。可见♂7在三龄期这一年共排精6次。

2.3 佛罗里达文昌鱼的繁殖次数

由表1可知，从二龄期到四龄期，期间有文昌鱼发生意外或自然死亡(表1)。至四龄期繁殖季节结束后(12月15日)还有4♀5♂，但是文昌鱼的状态欠佳，过冬期间大多死亡，到五龄期1月13日只剩下1♀1♂，不久后死亡，试验结束。每年中途死亡的个体不参与当年度平均繁殖频次的统计，另外终生不排精的♂10也不参与统计。这样参与统计分析的二龄期8♀9♂、三龄期5♀7♂、四龄期4♀5♂，不计年龄3年总共38尾(次)的年繁殖次数平均(6.8±1.5)次，其中雌性17尾(次)，产卵5～9次、平均(7.4±1.4)次；雄性21尾(次)，排精4～9次、平均(6.4±1.5)次，可见雌性产卵次数比雄性排精次数多。从不同龄文昌鱼的繁殖频次来看，二龄期可繁殖(7.3±1.4)次，三龄期(5.7±0.7)次，四龄期(7.4±1.7)次。

表1 佛罗里达文昌鱼个体水平的繁殖次数Table 1 Reproductive frequency of Branchiostoma floridae at the individual level

3 结论与讨论

3.1 影响文昌鱼繁殖的环境因素

目前，文昌鱼还只在实验室进行小规模的人工繁育，实验室饵料供给、海水盐度、温度、光照周期等外界因素都可能影响文昌鱼的生长和发育。在实验室通过提供足够的饵料、保持文昌鱼栖息沙层洁净可以保证文昌鱼正常生长以及性腺发育成熟[11]。本研究通过大量培养等鞭金藻、角毛藻、扁藻Platymonassubcordiformis、小球藻Chlorella等单细胞藻类，每天投喂以金藻、角毛藻为主的单细胞混合藻液，给文昌鱼提供了足量的饵料，同时经常清洗文昌鱼栖息沙层，保证文昌鱼的栖息环境适宜。文昌鱼性腺充分发育、具备了合适的繁殖生理条件后，它的繁殖时间主要取决于温度，水温的升高会促使文昌鱼性腺开始发育，到一定程度又可以促使其产卵[14]，实验室里佛罗里达文昌鱼产卵时的水温通常在22℃～28℃。光照周期长短对文昌鱼生殖细胞的发生和性腺生长也有显著的影响，佛罗里达文昌鱼产卵需要长光照条件[15]，文昌鱼对光敏感，黑暗条件有利于文昌鱼产卵[15]，文昌鱼产卵/排精发生在黑暗环境，为了工作方便，将实验室的文昌鱼长期饲养在人工控光周期(14 L∶10 D)条件下，即每天上午10:30开始连续黑暗10 h，晚上20:30开始连续光照14 h，在此光照周期条件下，实验室饲养的白氏文昌鱼B.belcheri、日本文昌鱼B.japonicum和佛罗里达文昌鱼都可以正常产卵繁殖。

3.2 佛罗里达文昌鱼的繁殖次数

人工饲养条件下，佛罗里达文昌鱼从4月份开始产卵，可以持续到12月份，其繁殖季节比较长，期间每个个体可以多次繁殖，雌性个体每年产卵5～9次、平均7.4次，雄性排精4～9次、平均6.4次，显示雌性的繁殖次数多于雄性；二龄期个体可以繁殖4～9次，平均7.3次；三龄期可以繁殖5～7次，平均5.7次，四龄期繁殖4～9次，平均7.4次。每次产卵或排精后，性腺需要经过一段时间得以恢复和重新发育，其所需时间间隔从数日到数月不等(表1)，这与每次产卵或排精时性腺的排空程度有关系，如果文昌鱼当次产卵/排精量大、性腺排空后就需要较长时间进行重新发育，如果当次产卵/排精量少、性腺没有排空，则间隔时间就短。性腺的发育需要有足够的营养作保障，有报道认为野生的佛罗里达文昌鱼能多次产卵，可能与其鳍条可以储藏营养、能提供多次繁殖所需的营养有关[7,10]，但是日本文昌鱼B.japonicum鳍条没有储备营养的功能[7]，本研究看不出佛罗里达文昌鱼多次产卵/排精是否与鳍条有关，在饲养条件下，通过供应饵料充足，保障多次繁殖所需的营养。

随着试验的进行，佛罗里达文昌鱼会逐渐死亡，本研究的试验动物寿命最长只达五龄期，四龄期之前有繁殖。关于佛罗里达文昌鱼的寿命和繁殖年龄目前还缺乏文献报道，我们实验室在饲养过程中子一代有个别可以存活到7龄期以上，期间从1龄期到6龄期都见有产卵，其中2龄期到4龄期可能是其繁殖的旺盛期。本研究观察了子三代一个小种群的繁殖情况，而不同代之间的繁殖力是否有差异有待于进一步观察。

3.3 不同种文昌鱼的繁殖频次

全世界的文昌鱼30种左右，研究报道主要是文昌鱼属Branchiostoma的白氏文昌鱼、日本文昌鱼、佛罗里达文昌鱼和欧洲文昌鱼B.lancelatum。在文昌鱼繁殖生物学研究方面，主要通过野外种群调查，文昌鱼每年有多次产卵，但不同种或同种的不同地理种群的产卵次数及间隔时间不同。白氏文昌鱼在厦门海域有2次产卵[13,16]；日本文昌鱼在有明海南部海区有2次产卵，两次之间大约间隔2周[7]，在濑户内海有3次产卵[17]，在青岛海域一年繁殖1次[18]，在厦门海区有2次产卵[13,16]；佛罗里达文昌鱼在同一个繁殖季节里，每间隔1～15 d就重复产卵[5]，但每个晚上参与产卵的成体数量时多时少；地中海的欧洲文昌鱼不同年份的产卵次数有1次或2次[10]。种群水平上的多次产卵既可能是不同个体性腺发育不同步带来的分批次繁殖，也可能是同一个体产卵后性腺重新发育成熟再次产卵的，或者两种情况同时存在。随着实验室文昌鱼繁育的成功，才有可能观测个体水平的繁殖情况，实验室饲养的白氏文昌鱼一年可以产卵2～4次[16,19]，而日本文昌鱼一年只产卵1次[16]，本研究佛罗里达文昌鱼从4月份到12月份可以多次产卵繁殖，从4～9次不等，可见不同种文昌鱼个体水平上的产卵频次有较大的区别，从产卵频次看，佛罗里达文昌鱼的繁殖力明显比较强，选择它作为水产养殖对象或作为科研模式生物都具有明显优势。