正交试验法优化灵芝菌丝体γ-氨基丁酸提取工艺

王玲芝，白 雪，蒋咏梅

(福建师范大学生命科学学院， 福建 福州 350007)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)别名4-氨基丁酸，由F.C.Stewar等[1]和Roberts等[2]在马铃薯和哺乳动物脑萃取液中首次发现。GABA是一种天然的非蛋白氨基酸，具有降血压、抗癫痫和改善脂质代谢等生理功能[3]。2009年我国卫生部将其列为6种新型食品资源之一，GABA又增添了制备富含GABA的奶制品和调味料新型酱[4]等保健食品的新用途，需求日益增长。

GABA广泛分布于动物、植物以及微生物中，其合成方式主要包括化学合成法、植物富集法以及生物合成法[5]3种。利用微生物发酵获取GABA成本低、产量高，且不受环境资源限制[6]。目前多通过筛选高产菌株[7]或者生物改造菌株提高GABA的产量，如肖秋颖等[8]从牦牛酸乳中筛选得到GABA高产菌株；郑鸿雁等[9]对假丝酵母进行紫外诱变，使其GABA产量提高了40.25%；乌云达来等[10]通过分子生物学手段提高谷氨酸脱羧酶活力达到酵母高产GABA的目的。高产GABA后，如何从生物体中高效率地提取GABA至关重要，近年来学者们主要对桑叶[11]、茶[12]、米糠胚芽[13]等体内GABA的提取工艺进行优化，很少有从微生物中提取GABA的相关研究。

灵芝作为一种传统的药用真菌，在保健和医药行业具有广阔的前景[14]。研究发现，灵芝除含有灵芝酸、灵芝多糖之外，也含有γ-氨基丁酸[15-16]等多种活性物质。学者们探讨过灵芝提取物对人体摄取GABA的变化[17]，也研究过将GABA和灵芝有效活性成分进行药片的制作来改善睡眠[18]，但是目前鲜有学者研究如何提取灵芝中的GABA。灵芝的培养方式不同，得到的有效物质和药用价值也有所不同[19]，如灵芝振荡-静置两阶段培养比深层发酵获得的总三萜高2.5倍[20]。因此，本试验以两阶段培养的灵芝菌丝体为研究对象，探讨浸提时间、浸提温度、料液比和超声功率4个单因素对灵芝GABA提取率的影响，并在此基础上进行正交试验，确定灵芝中GABA的最优提取工艺，为灵芝和GABA的后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1试验材料 灵芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst(福建师范大学国家教育部工业微生物研究工程中心保藏)。

1.1.2试剂与仪器 试剂：γ-氨基丁酸标准品(阿拉丁)，苯酚，无水乙醇，硼酸，硼砂，氢氧化钠，次氯酸钠(≥8%)。

仪器：PHS-3CpH计(赛多仪器有限公司)，TG16-WSD台式高速离心机(湖南湘仪仪器有限公司)，QL-910漩涡混合器(江苏其林贝尔仪器有限公司)，SHP-150生化培养箱(精宏设备有限公司)，BHS-2数显恒温水浴锅(福州泰关实验仪器有限公司)，UV-1100紫外分光光度计(上海美普达仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1灵芝菌丝体的制备 灵芝菌丝体发酵培养参照丁延青[21]方法，将液态静置培养得到的灵芝菌丝体白膜放置在平板中，50℃烘干至恒重，用研钵将其充分研磨成粉末，用10 mL EP管于4℃保存。

1.2.2单因素试验 (1)温度对灵芝菌丝体GABA提取的影响。称取灵芝发酵菌丝体0.05 g倒入5 mL离心管中，按照料液比1∶30加入1.5 mL蒸馏水，分别在常温、35℃、55℃、75℃以及沸水中浸提30 min，离心得到待测样品。(2)料液比对灵芝菌丝体GABA提取的影响。称取灵芝菌丝体0.05 g倒入5 mL的离心管中，加入料液比1∶20、1∶30、1∶40和1∶50的蒸馏水，即1、1.5、2和2.5 mL，于55℃的水浴浸提30 min，离心得到待测样品。(3)浸提时间对灵芝菌丝体GABA提取的影响。称取灵芝菌丝体0.05 g倒入5 mL的离心管中，按照料液比为1∶30加入1.5 mL蒸馏水，放入55℃的水温中，分别浸提50、60、70、80、和90 min，离心得到待测样品。(4)超声功率对灵芝菌丝体GABA提取的影响。称取灵芝菌丝体0.05 g倒入5 mL的离心管中，按照料液比1∶30加入1.5 mL蒸馏水，放入55℃的水浴中，浸提时间为70 min，分别在0、200、250、300、350以及400 W功率超声，离心得到待测样品。

1.2.3正交试验设计 依据单因素试验的结果，对料液比，浸泡温度，浸泡时间和超声功率，选取合适的区间，采用相关软件spass设计方法对单因素进行L9(43)设计与分析。每组因素做3个平行，取平均值。

表1 正交试验因素水平编码表Table 1 Horizontal coding table of the orthogonal experimental factors

1.2.4GABA含量的测定 采用Berthelot显色反应[22]测定GABA，加入蒸馏水溶解0.01 g的GABA标准样品定容于10 mL容量瓶，配制成1 g·L-1的标准液。再稀释为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 g·L-1的标准溶液，取0.5 mL，加入试管中。再向试管依次加入0.2 mL质量分数为0.2 mol·L-1、pH 9.0的硼酸盐溶液，0.4 mL次氯酸钠和1 mL 6%的苯酚溶液，震荡摇匀，沸水水浴10 min后，立即放入冰水浴20 min，取出后加入质量分数60%的乙醇溶液2 mL，震荡混匀，静置10 min。然后在640 nm测OD值。以GABA浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线，见图1。标准方程为Y=1.6645X+0.1411，R2=0.973。当GABA浓度超过1 g·L-1时，需要对样品进行稀释。

图1 GABA标准曲线Fig.1 Standard Curve of GABA

1.2.5数据处理 每组3个平行试验，取平均值，利用Excel 2016作图和Spass PASW Statistics对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.2.1浸提温度对灵芝粉GABA提取的影响 由图2可知，在一定温度范围内，GABA含量随温度的上升而增高，55℃效果最好。当温度超过55℃，GABA提取含量变化趋于平缓，这与浸提温度对灵芝多糖提取率相同[23]，高温时，GABA提取含量变化不明显，说明GABA对温度不敏感，这可能是因为GABA的熔点高，不易分解[24]。考虑到节能，选择55℃为最适提取温度。

图2 浸提温度对GABA提取的影响Fig.2 Effect of the extraction temperature on the extraction of GABA

2.1.2料液比对灵芝粉中GABA提取的影响 由图3可知，料液比最低比例为1∶20，因为前期发现料液比低于1∶20时，离心之后无法提取足够的样品体积，所以本试验设定最低料液比体积为1∶20。料液比为1∶30时，GABA提取含量最高，为1.133 mg·g-1，比料液比1∶20提高了77.58%。这与杨晶晶[25]提取三七茎叶中GABA规律一样。干燥的灵芝菌丝体吸收提取液，料液比1∶30、1∶40、1∶50灵芝菌丝体内GABA的提取含量差异不大，而且新增添溶剂体积会影响热学[26]，导致浸提时间的延长和材料的浪费。从节省材料角度考虑，1∶30的料液比最好。

图3 料液比对GABA提取的影响Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction of GABA

2.1.3浸提时间对灵芝粉GABA提取的影响 由图4可知，在浸提温度55℃、料液比1∶30时，浸提灵芝菌丝体中的GABA提取含量随浸提时间的延长先增加后降低。50～60 min，GABA增长缓慢，60～70 min，灵芝GABA提取含量上升较快，达到最大值。当浸提时间超过70 min，GABA含量会随着时间的增加而显著降低。这是一个固液非均相的浸提过程[27]，GABA从固体转移到液体，并溶解于水中，需要一定的时间，时间过短，GABA与水溶解不充分，因此GABA提取含量会随着时间的延长而提高，当固液GABA达到平衡，继续加大时间，可能导致GABA的分解和灵芝细胞内的其他物质的溶解，干扰GABA的测定，从而使GABA提取含量下降。

图4 浸提时间对GABA提取的影响Fig.4 Effect of the extraction time on the extraction of GABA

2.1.4超声功率对灵芝粉GABA提取的影响 由图5可知，超声功率的变化虽然对灵芝体内GABA提取率有一定的影响，但差异并不显著。本试验选择超声功率作为其中一个单因素试验，是因为灵芝细胞不被破环的情况下，体内的有效活性成分需要破壁透过细胞壁才能释放[28]，付丽丽等[29]超声协同提取灵芝多糖比传统水提法高出1.7倍。超声波可以破坏灵芝的细胞壁、细胞膜。不同功率时，效果不同。功率的起始以灵芝孢子粉药渣多糖提取为参照[30]，上下浮动100 W。

图5 超声功率对GABA提取的影响Fig.5 Effect of the ultrasonic power on the extraction of GABA

2.2 正交试验结果

由表2可知，4个因素中浸提时间是提取灵芝菌丝体中GABA的最关键的因素，其次是超声功率、料液比，影响最小的是浸提温度。通过对比各因素之间的关系，得到最理想的优化条件为A3D1C3B3，即浸提时间为80 min，超声功率300 W，料液比1∶30，浸提温度80℃。通过验证试验，3次平行试验所提取的灵芝GABA含量均值为1.700 mg·g-1。

3 讨论与结论

γ-氨基丁酸(GABA)作为哺乳动物的重要神经递质，一种新型的功能因子，具有抗癫痫、治疗焦虑和降血压等功能，在保健和食品等领域应用广泛，因此提高生物体内GABA获取率尤为重要。采用浸提法提取GABA时，浸提时间、浸提温度、料液比以及超声功率是工艺优化的关键因素。浸提时间的长短会影响物质是否与溶剂充分溶解，浸提温度的高低会影响物质的析出[31]，料液比的多少影响溶质的接触面积，超声功率的大小会影响物质的穿透力[32]。

本试验根据GABA易溶于水微溶于醇的特性[33]，采用水提法对以上因素展开单因素试验，并且在单因素试验基础上，以GABA含量为指标，选择有代表性和差异性，设置水平和因素，展开四因素三水平的正交试验，结合数据分析得到4个因素对提取GABA含量都有不同程度的影响，即浸提时间>超声功率>料液比>浸提温度，最终确定浸提时间80 min，浸提温度80℃，料液比1∶30以及超声功率300 W为灵芝粉中γ-氨基丁酸最适提取条件，该研究可为GABA的提取以及进一步的应用提供参考。