尿液外泌体来源hsa_circ_0008925与IgA肾病肾脏纤维化的相关性研究

史媛慧，吴章丽，彭娜娜，肖 杰，徐晶晶，窦 璠，曹玉涵

(1.皖南医学院 a.研究生学院；b.麻醉学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 肾脏内科，安徽 芜湖 241001)

IgA肾病(immunoglobulin A nephropathy，IgAN)是全球范围内最常见的原发性肾小球肾炎，约占中国人群原发性肾小球疾病的45%[1]。约20%～40%IgAN患者会出现肾功能减退，并在20～30年内发展为终末期肾脏病[2]。肾脏纤维化几乎是所有慢性肾脏病进展至终末期肾病的主要病理改变。目前，肾脏纤维化的诊断主要基于肾穿刺活检病理[3]。然而，肾穿刺活检是一种创伤性操作，可能出现出血、感染等严重并发症，更无法实时、动态了解肾脏纤维化进程。研究证实尿液外泌体携带着肾脏固有细胞来源的生物学信息，如蛋白质、核酸等多种信号分子[4]。研究发现，环状RNA(circular RNAs，circRNAs)在外泌体中富集且稳定，尿液中circRNAs可能作为肾脏纤维化的潜在生物标志物[5]。

本研究通过检测IgAN患者尿液外泌体hsa_circ_0008925表达量与健康对照的表达差异，并进一步分析尿液外泌体hsa_circ_0008925与肾脏纤维化的相关性，探讨尿液外泌体hsa_circ_0008925表达量对IgAN肾脏纤维化的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018～2019年于弋矶山医院肾内科肾穿刺活检确诊的IgAN患者30例和34例健康对照者。排除标准：①年龄<18岁或年龄>80岁；②合并继发性肾脏疾病，如狼疮性肾炎、乙肝相关性肾炎等；③泌尿系统急、慢性感染；④存在严重的心血管疾病、恶性肿瘤、肝功能异常等；⑤临床病例资料不全的患者。本研究经弋矶山医院伦理委员会批准，所有入选患者均签署知情同意书。

1.2 尿标本收集及其外泌体提取 肾穿刺活检前一天收集晨尿约100 mL。晨尿样本经4℃、3 000 g离心30 min后，收集上清液，经4℃、13 500 g离心30 min，再次收集上清液，经4℃、100 000 g超速离心70 min，弃上清，收集沉淀即为尿液外泌体，重悬于100 μL PBS缓冲液。

1.3 尿液外泌体RNA提取 使用Trizol-LS试剂(Ambion)，按照生产商提供的使用说明书提取尿液外泌体总RNA。

1.4 逆转录和实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 使用反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa)逆转录合成cDNA，Real Time PCR试剂盒(TB Green Premix Ex Taq，TaKaRa)进行cDNA扩增，检测hsa_circ_0008925的表达情况，U6作为内参。设计引物如下，hsa_circ_0008925正向引物：5′-TTATGGCTGTCCTTGGGAGTTT-3′；反向引物：5′-GGTATTCTCGGTCTGTTTTGGA-3′。U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-qPCR反应程序：反转录(37℃，15 min；85℃，5 s)，热启动(95℃，10 min)，40个PCR循环(95℃，10 s；60℃，1 min)。

1.5 肾脏纤维化检测 肾穿刺活检样本固定于10%中性福尔马林24 h，常规脱水、包埋、切片(厚度3 μm)、脱蜡、染色、脱水、封片、镜检。Masson染色评估肾小管间质纤维化。纤维化分级：①0级，无纤维化；②1级，轻度纤维化，纤维化面积0～25%；③2级，中度纤维化，纤维化面积26%～50%；④3级，重度纤维化，纤维化面积>50%。

2 结果

2.1 IgAN患者与健康对照者的基线临床和病理资料分析 IgAN组和对照组在年龄、性别和收缩压上差异均无统计学意义(P>0.05)，IgAN组中舒张压、血肌酐、血尿素氮、胱抑素C均高于对照组(P<0.001)，而肾小球滤过率(eGFR)低于对照组(P<0.001)。与对照组相比，尿液外泌体hsa_circ_0008925相对表达量在IgAN组中上调(P<0.001)，详见表1。

2.2 不同纤维化程度IgAN患者基线临床和病理资料分析 根据肾脏纤维化程度将IgAN患者分为2组：无-轻度纤维化组(纤维化面积≤25%)(n=8)；中-重度纤维化组(纤维化面积>25%)(n=22)。两组间年龄、性别、收缩压、舒张压、血肌酐、血尿素氮、胱抑素C、eGFR、24 h尿蛋白差异均无统计学意义(P>0.05)。与无-轻度纤维化组相比，尿液外泌体hsa_circ_0008925相对表达量在中-重度纤维化IgAN组上调,详见2。

2.3 尿液外泌体hsa_circ_0008925表达量与临床病理指标相关性分析 Spearman相关性分析提示，尿液外泌体hsa_circ_0008925表达水平与血肌酐(rs=0.376，P=0.002)、胱抑素C(rs=0.491，P<0.001)均呈正相关；与eGFR(rs=-0.334，P=0.007)呈负相关。其他详见表3。

表1 IgAN患者与健康者的基线临床和病理资料对比

表2 不同纤维化程度IgAN患者基线临床和病理资料对比

表3 尿液外泌体hsa_circ_0008925与血肌酐、血尿素氮、胱抑素C、eGFR、24 h尿蛋白相关性分析

2.4 尿液外泌体hsa_circ_0008925对IgAN肾脏纤维化的诊断价值 ROC曲线分析提示尿液外泌体hsa_circ_0008925可以区分中-重度纤维化和无-轻度纤维化的IgAN患者(AUC=0.778，95%CI：0.610～0.947，P=0.022)，当尿液外泌体hsa_circ_0008925相对表达量为0.089时可区分无-轻度纤维化和中-重度纤维化的IgAN患者，灵敏度为72.7%，特异度为87.5%(图1)。而eGFR(AUC=0.372，95%CI：0.174～0.570，P=0.291)、血肌酐(AUC=0.588，95%CI：0.380～0.797，P=0.467)、胱抑素C(AUC=0.685，95%CI：0.492～0.877，P=0.127)对中-重度纤维化和无-轻度纤维化的IgAN患者无诊断价值。

图1 ROC曲线分析尿液外泌体hsa_circ_000892、eGFR、血肌酐及胱抑素C对不同纤维化程度IgAN患者的诊断价值

3 讨论

早期、无创性诊断肾脏纤维化，是临床上亟待解决的科学问题。迄今尚无可靠的可诊断肾脏纤维化的无创性生物标志物[6]。尿液中蕴含丰富的生物学信息，尿液中有来自肾脏的脱落细胞。尿液离心后获得的尿沉渣细胞可作为反映肾脏病理生理改变的信息来源[7]。近年来，以实时定量聚合酶链式扩增反应(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)为基础的尿液非编码RNA生物标志物检测成为研究热点。Li等[8]首次用RT-PCR方法检测尿沉渣细胞中穿孔素及颗粒酶B的mRNA，可作为诊断异体肾移植急性排斥反应的生物标志物。外泌体是细胞来源的纳米级囊泡，可将携带的非编码RNA传递至细胞外，作为细胞间信息交换的重要工具。Feng等[9]发现尿液外泌体携带的CCL2 mRNA可作为评估IgAN患者肾脏损害的潜在生物标志物。

circRNAs是一类具有闭合环状结构的非编码RNA，不受RNA外切酶影响，能够在细胞及体液内稳定存在，不易降解。最新研究表明，circRNAs在外泌体中富集且稳定，可以在尿液中检测到[10]。Luan等[11]在IgAN患者的尿液外泌体中发现了差异表达的circRNAs，提示外泌体中circRNAs在IgAN的发生、发展中发挥重要作用，可作为IgAN分子病因学和非侵入性生物标志物。Luan等[12]通过对比IgAN患者和健康对照者circRNAs表达谱，发现在IgAN患者中发现了476个表达差异circRNAs，但并未进一步分析具有差异性的circRNAs是否可作为诊断IgAN的非侵入性生物标志物。

本研究基于RT-PCR检测方法来寻找IgAN患者尿液肾脏纤维化的生物标志物，发现IgAN患者尿液外泌体hsa_circ_0008925表达水平显著高于健康对照组。进一步比较IgAN患者不同纤维化程度尿液外泌体hsa_circ_0008925表达量，发现尿液外泌体hsa_circ_0008925表达水平与肾脏纤维化严重程度呈正相关。此外，本研究进一步发现尿液外泌体hsa_circ_0008925表达水平与血肌酐、胱抑素C呈正相关，与eGFR呈负相关。ROC曲线提示尿液外泌体hsa_circ_0008925表达量可区分不同纤维化程度的IgAN患者，且AUC优于eGFR、血肌酐以及胱抑素C等传统临床生化指标。hsa_circ_0008925的染色体定位位于chr6:108222573-108246136，其基因名称为SEC63。SEC63编码内质网膜中一种常驻蛋白，SEC63失活后导致多囊蛋白1介导的多囊肾病的发生[13]。既往有研究报道，肾小管内SEC63失活后导致蛋白稳态失调，激活Ire1-α/Xbp1通路，从而促进炎症反应、肌成纤维细胞增多和细胞外胶原沉积，进而发展为肾间质纤维化[14]。

本研究通过对尿液外泌体中circRNAs检测，初步发现尿液外泌体hsa_circ_0008925可作为诊断IgAN患者肾脏纤维化的可靠、无创性生物标志物。本研究的局限性在于样本量小，需扩大样本量进一步验证，并且hsa_circ_0008925在IgAN和肾脏纤维化中的分子生物学机制需进一步研究。综上所述，尿液外泌体来源的hsa_circ_0008925可能成为诊断IgAN肾脏纤维化的无创性生物标志物，为IgAN肾脏纤维化的诊疗提供新的思路。