花青素对慢性炎性痛大鼠中枢TRPV1表达的影响

张祥涛，赵辰爽，谢聪颖，熊彬睿，陈雪梅，李 慧，余恬恬，王 静

(皖南医学院 1.药学院；2.研究生学院；3.检验学院；4.基础医学院，安徽 芜湖 241002)

慢性疼痛是临床常见病症，治疗难度大且疗效不佳，严重影响人类生活质量[1]。促炎和抗炎细胞因子失衡导致的炎症是慢性痛发生发展的关键原因[2]，中枢瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调控，在慢性炎性痛中具有重要作用[3-4]。花青素(anthocyanin,Ant)是一类天然水溶性色素，广泛存在于各种植物的花、果和叶片中，如蓝莓、桑葚、金叶女贞等。Ant具有较强的抗氧化、抗衰老、抗炎、抑菌等多种功效，能降低体内的氧化应激和炎症水平[5-7]，课题组前期研究也证实Ant的抗氧化、抗炎镇痛作用[8-9]。Ant可通过血脑屏障到达中枢，抑制氧化应激和神经炎症从而对神经系统发挥保护作用[10-11]。本研究拟用完全弗氏佐剂(complete freund′s adjuvant,CFA)诱导经典的慢性炎性痛模型，观察Ant对CFA诱导的慢性炎性痛作用效果，为开发Ant治疗慢性炎性痛药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.2 药品与试剂 CFA，sigma公司；Ant提取自金叶女贞果实，经烘干、过筛、提取、吸附，去糖去脂得100%纯Ant粉末，生理盐水配制成溶液使用；TRPV1一抗(abcam公司，ab10296)，二抗(博士德公司，SV0002)。

1.3 实验仪器 热刺痛仪(PL-200，成都泰盟科技有限公司)；电子压痛仪(BW-YLS-3E，上海软隆科技公司)；足趾容积测量仪(YLS-7B，上海软隆科技公司)。

1.4 实验动物分组 30只大鼠常规适应饲养1周后随机分为3组(n=10)，对照组：左后肢足底皮下注射生理盐水100 μL；模型组：左后肢足底皮下注射CFA 100 μL诱导慢性炎性痛模型；Ant组(Ant)：左后肢足底皮下注射CFA 100 μL，同天开始Ant(根据前期实验摸索Ant浓度为90 mg/kg)灌胃1周。

1.5 慢性炎性痛模型建立 依据文献[12]建造慢性炎性痛模型，经行为学观察和痛觉评分，造模成功率100%。

1.6 痛行为观察及分析评价 模型组和Ant组大鼠在注射CFA后1、15、30 min及1、3、5、7 d共7个时间点，按文献[13]标准记录疼痛评分。

1.7 大鼠体质量监测 清晨大鼠在清醒、安静状态下，于实验开始前和术后1、3、5、7 d相同时间点测量各组大鼠体质量。

1.8 足趾容积测量 清晨大鼠在清醒、安静状态下，用足趾容积测量仪在实验开始前和术后1、3、5、7 d相同时间点测量大鼠左侧后足趾容积。

1.9 热痛阈值和机械痛阈值检测 参照文献[9]在造模前和造模后1、3、5、7 d测定各组大鼠的热痛阈值(heat pain threshold，HPT)和机械痛阈值(mechanical pain threshold，MPT)。

1.10 炎性因子检测 ELISA法检测血清和炎症部位PGE2、TNF-α、IL-6含量，具体方法按试剂盒说明进行。

1.11 中枢TRPV1蛋白表达检测 Western blot检测中枢丘脑、蓝斑、海马区TRPV1表达，TRPV1条带灰度值与内参蛋白β-actin条带的灰度值之比表示TRPV1表达量，再以对照组TRPV1表达量为1，计算模型组和Ant组TRPV1的相对表达量。

2 结果

2.1 Ant对慢性炎性痛大鼠体质量的影响 各组大鼠体质量缓慢增长，且3组大鼠体质量增长速度差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 CFA诱导的慢性炎性痛大鼠痛行为评分 模型组和Ant组大鼠在注射CFA后即刻引发痛觉行为，均出现尖叫、躁动不安、注射足不敢触地、舔舐注射足及抖动注射足等现象。时间与分组对痛行为评分存在交互效应，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，Ant组注射CFA后5 d痛行为评分开始降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3 Ant对慢性炎性痛大鼠足趾容积的影响 时间与分组对足趾容积变化存在交互效应，差异有统计学意义(P<0.01)。对照组大鼠足趾容积无明显变化，模型组和Ant组大鼠在注射完CFA 1 d后足趾容积明显增大(见图1)，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，Ant组在注射CFA 7 d足趾容积减小，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1 Ant对慢性炎性痛大鼠体质量的影响

表2 注射CFA后不同时间点大鼠疼痛评分

表3 Ant对慢性炎性痛大鼠足趾容积的影响

图1 CFA诱导慢性炎性痛大鼠左后肢肿胀图

2.4 Ant对慢性炎性痛大鼠HPT的影响 时间与分组对HPT变化存在交互效应，差异有统计学意义(P<0.01)。模型组和Ant组在注射CFA后，HPT明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，Ant组在注射CFA后5 d HPT开始回升，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

2.5 Ant对慢性炎性痛大鼠MPT的影响 时间与分组对MPT变化存在交互效应，差异有统计学意义(P<0.01)。模型组和Ant组在注射CFA后1 d MPT下降，差异有统计学意义(P<0.01)；Ant组在注射CFA后5 d与模型组差异有统计学意义(P<0.01)，见表5。

2.6 Ant对慢性炎性痛大鼠血清及足趾浸浴液的炎性因子影响 与对照组相比，模型组的大鼠血清和足趾浸浴液中PGE2、TNF-α、IL-6均升高(P<0.01)；与模型组相比，Ant组的大鼠血清和足趾浸浴液中PGE2、TNF-α、IL-6均降低(P<0.05)，见表6。

2.7 Ant对慢性炎性痛大鼠中枢TRPV1表达的影响 与对照组相比，模型组大鼠中枢丘脑、海马、蓝斑TRPV1蛋白表达均增加(P<0.01)；与模型组相比，Ant降低了中枢丘脑(P<0.05)、海马(P<0.05)、蓝斑(P<0.01)TRPV1蛋白表达，见图2。

表4 Ant对慢性炎性痛大鼠HPT的影响

表5 Ant对慢性炎性痛大鼠MPT的影响

表6 Ant对慢性炎性痛大鼠血清及足趾浸浴液中炎性因子影响

与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

组织器官在受到伤害性刺激时会出现典型的红、肿、热、痛等局部炎症反应；炎症严重时会伴有发烧、白细胞增多、毛细血管通透性增加等症状。本研究用CFA诱导经典慢性炎性痛模型，注射CFA后动物即刻引发痛觉行为，出现躁动不安、注射足不敢触地、舔舐注射足及抖动注射足等痛觉行为，局部组织周围出现红肿、痛觉过敏持续一周。

TRPV1属于瞬时受体通道的一个亚型，广泛表达于外周感觉神经元和大多脑区中，包括所有的皮质区，部分边缘系统(海马、中央杏仁核)、蓝斑、下丘脑及黑质。TRPV1作为痛觉信息传递系统的第一站，能被多种伤害性刺激激活，包括辣椒素、高热、机械以及疼痛等，激活后引起Na+、Ca2+、Mg2+等阳离子跨膜移动，并将其转换为动作电位向脊髓、丘脑及高位脑中枢传递并最终产生痛觉，同时伴随降钙素基因相关肽、P物质(Substance P,SP)等神经递质的释放参与神经源性炎症反应[14]。而炎性因子如SP、神经生长因子、PGE2、缓激肽等也可以通过激活G蛋白耦联受体致敏TRPV1，导致TRPV1通道阈值降低，从而放大疼痛和产生炎症[15-17]。TRPV1与炎性因子形成互相促进的效应，加剧了痛觉感受，本研究也证实了这一结果，Ant组大鼠从丘脑至海马、蓝斑区域的TRPV1表达均有降低，这可能与Ant降低炎性因子释放有关，从而缓解痛觉感受。

研究发现TRPV1被激活后虽然暂时引起剧痛，但长时间激活后却能抑制后续的疼痛。所以TRPV1的抑制剂和强激动剂都有可能成为止痛药的研究对象[18]。Ant的抗炎、镇痛作用已初现端倪，但其机制仍不十分明确；本研究证实了Ant可能通过抑制TRPV1表达发挥镇痛作用，为开发Ant的镇痛作用提供了理论基础，本课题组将继续研究Ant如何通过TRPV1通道发挥抗炎镇痛作用。