荷叶水煎剂对家兔小肠平滑肌的收缩效应及机制研究#

李佳汶 李鑫月 邹金池 刘铭 肖馨懿 赵曦 买文丽 刘华△

（1．川北医学院临床医学系，四川 南充 637000；2. 川北医学院预防医学系，四川 南充 637000；3. 川北医学院机能中心，四川 南充 637000）

荷叶为睡莲科莲属莲的干燥叶，夏、秋二季采摘，是药食两用性植物。荷叶具有清暑化湿、升发清阳、凉血止血的功效[1]。现代医学研究显示，荷叶提取物具有降脂、保肝和抑菌等作用[2，3]，但荷叶提取物对小肠平滑肌的影响的研究较少。本研究用不同浓度的荷叶水煎剂灌流家兔小肠平滑肌，观察其对小肠平滑肌收缩的影响，并探讨其影响机制，为探索荷叶的药用价值，对其进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、仪器与试剂

健康家兔20只（川北医学院机能中心提供），体重2～2.5 kg，雌雄不限。仪器主要为恒温平滑肌实验系统（四川成都泰盟科技有限公司），BL-420生物记录系统（四川成都泰盟科技有限公司），荷叶（湖北金贵中药饮片有限公司，批号：A191101），乙酰胆碱（华夏化学试剂有限公司，批号：2017032301），阿托品（湖北兴华制药有限公司，批号：20160303），维拉帕米（上海禾丰制药有限公司，批号：43200101）以及多巴胺（亚邦医药股份有限公司，批号：1911011）。

1.1.2 荷叶煎剂的制备

用荷叶生药100 g洗净切碎，加入蒸馏水1000 mL，浸泡60 min，煮沸30 min，过滤。重复煎煮一次，过滤。将两次滤液合并煎煮浓缩至100 mL，荷叶水煎剂的浓度为1000 g·kg-1。

1.1.3 家兔离体肠肌的制备

实验前家兔禁食12 h，正常饮水。用木槌击兔头延髓部致昏，迅速剖开腹腔，取靠近胃部约10 cm肠段置于装有37 ℃台式液的培养皿中轻轻漂洗，并将离体肠管分段，每段长1.5-2 cm。将肠段固定在恒温平滑肌灌流槽中。

1.2 方法

1.2.1 荷叶水煎剂对小肠平滑肌收缩的影响

记录用药前肠管收缩波形5 min后，向恒温灌流槽中依次加入不同剂量的荷叶水煎剂，使浴管内台氏液含药量按0.2、0.4、0.6、0.8、1 g·kg-1的梯度依次增加，同一浓度分别作用于不同的肠管，重复10次，分别记录肠管的收缩张力和频率变化情况。

1.2.2 探究荷叶水煎剂与钙离子通道的关系

记录用药前的肠管收缩波形 5 min后，向浴槽内加入维拉帕米使浴管内台氏液含药量达到5 g·kg-1，待肠管稳定后加入0.8 g·kg-1的荷叶水煎剂，重复10次，分别记录肠管收缩张力变化情况。

1.2.3 探究荷叶水煎剂与多巴胺受体的关系

记录用药前的肠管收缩波形5 min后，向浴槽内加入多巴胺使浴管内台氏液含药量达到2 g·kg-1，待肠管稳定后加入0.8 g·kg-1的荷叶水煎剂，重复10次，分别记录肠管收缩张力变化情况。

1.2.4 探究荷叶水煎剂与M受体的关系

记录用药前的肠管收缩波形5 min后，先向浴槽加入乙酰胆碱使浴管内台氏液含药量达到0.5 g·kg-1，待肠管稳定后加入阿托品5 g·kg-1，待波形稳定后加入的荷叶水煎剂0.8 g·kg-1，重复10次，分别记录肠管收缩张力变化情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS24.0软件进行数据分析，频率和张力用配对样本和t检验，计量资料以均数±标准差（± SD）表示，组间比较用单因素方差分析进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷叶水煎剂对小肠平滑肌收缩的影响

与正常组相比，荷叶水煎剂浓度在0.2-0.8 g·kg-1时的收缩张力均明显增加（P＜0.05），而且随着荷叶水煎剂浓度的增加收缩力逐渐增强，在浓度为0.8 g·kg-1组更为显著（P＜0.05）；但各组收缩频率无明显变化（P＞0.05），见图1、表1。

表1 不同浓度荷叶水煎剂对家兔胃肠道平滑肌收缩张力和收缩频率的影响（SD，n=10)

表1 不同浓度荷叶水煎剂对家兔胃肠道平滑肌收缩张力和收缩频率的影响（SD，n=10)

注：与正常组比较，*P＜0.05。

荷叶水煎剂浓度(g·kg-1) 用药后收缩张力(g) 用药后收缩频率(Hz) 正常组(0) 1.87±0.19 0.18±0.43 0.1 1.95±0.24 0.21±0.41 0.2 2.07±0.28* 0.20±0.39 0.4 2.15±0.25* 0.18±0.50 0.6 2.24±0.27* 0.19±0.50 0.8 2.33±0.26* 0.21±0.37

图1 代表性小肠平滑肌收缩波形图

2.2 荷叶水煎剂与钙离子通道的关系

与干预前相比，维拉帕米组的收缩张力明显降低（P＜0.01）；而与维拉帕米组相比，维拉帕米+荷叶水煎剂组的收缩张力无明显变化（P＞0.05），见图2、表2。

表2 对家兔小肠平滑肌依次加入维拉帕米和荷叶水煎剂后其平均收缩力的变化（±SD，n=10）

表2 对家兔小肠平滑肌依次加入维拉帕米和荷叶水煎剂后其平均收缩力的变化（±SD，n=10）

注：与正常组组比较，#P＜0.01。

分组 收缩张力(g)正常组3.02±1.00维拉帕米1.85±0.67# 维拉帕米+荷叶水煎剂1.78±0.63#

图2 代表性与钙离子通道关系收缩波形图

2.3 荷叶水煎剂与多巴胺受体的关系

与正常组相比，多巴胺组的收缩张力明显降低（P＜0.01）；而与多巴胺组相比，多巴胺+荷叶水煎剂组的收缩张力无明显变化，见图3、表3。

表3 对家兔小肠平滑肌依次加入多巴胺和荷叶水煎剂后其平均收缩力的变化（X±SD，n=10)

图3 代表性与多巴胺受体关系收缩波形图

2.4 荷叶水煎剂与M受体的关系

与正常组相比，乙酰胆碱组的收缩张力升高（P＜0.01）；与乙酰胆碱组相比，乙酰胆碱+阿托品组的收缩张力降低（P＜0.01）；而与乙酰胆碱+阿托品组相比，乙酰胆碱+阿托品+荷叶水煎剂组的收缩张力明显升高（P＜0.01），见图4、表4。

图4 代表性与M受体关系收缩波形图

表4 对家兔小肠平滑肌依次加入乙酰胆碱、阿托品和荷叶水煎剂后其平均收缩力的变化（SD，n=10)

表4 对家兔小肠平滑肌依次加入乙酰胆碱、阿托品和荷叶水煎剂后其平均收缩力的变化（SD，n=10)

注：相邻组间组比较，#P＜0.01。

分组 收缩张力(g)正常组1.74±0.39 乙酰胆碱4.17±1.49# 乙酰胆碱+阿托品1.19±0.46# 乙酰胆碱+阿托品+荷叶水煎剂1.52±0.41#

3 讨论

荷叶是我国传统的一种养生保健食材，其主要化学成分为荷叶生物碱、荷叶苷、挥发油、多糖以及有机酸[4，5]，但荷叶对消化道的作用的相关研究较少。本研究通过不同浓度的荷叶水煎剂灌流家兔离体小肠平滑肌发现，灌流浓度在0.2 g·kg-1-0.8g·kg-1范围内，小肠平滑肌的收缩力增强，并有剂量依赖性，而收缩节律无明显变化。

Cajal间质细胞（Interstilial cell of Cajal，ICC）是胃肠运动的起搏细胞。目前认为，当ICC内Ca2+浓度升高可激活细胞膜上钙激活的氯通道，Cl-外流，膜电位去极化，形成慢波电位[6，7]。慢波电位引起平滑肌电压门控性钙通道开放，Ca2+内流到达阈电位，引发动作电位，导致平滑肌细胞收缩。并且慢波的频率和数量决定了肠平滑肌运动的频率和强度。实验中荷叶水煎剂浓度在0.2 g·kg-1-0.8 g·kg-1时，随着浓度的增加，小肠平滑肌的收缩能力增强，而频率变化不大。说明荷叶水煎剂对ICC细胞的去极化和复极化过程影响较小，而对平滑肌的Ca2+内流影响较大。在实验中，加入Ca2+通道抑制剂维拉帕米后，肠平滑肌收缩幅度出现明显下降；此后加入荷叶水煎剂肠肌收缩力并无明显升高。

由此可知，荷叶水煎剂并不能改善钙通道抑制剂维拉帕米对平滑肌活动的抑制作用，说明荷叶水煎剂对钙通道并无直接的兴奋作用。多巴胺（Dopamine，DA）可以调节肠道运动。Auteri 等发现，DA和D1体结合，诱导肠肌运动增强；而与D2受体结合，使肠肌肉松弛[8-9]。一氧化氮是消化道内重要的抑制性神经递质，通过cGMPPKG途径使平滑肌超极化，从而抑制平滑肌的收缩活动[10]。多巴胺可激活一氧化氮神经元上的多巴胺受体，抑制胃肠运动[11]。本文研究发现加入多巴胺后平滑肌收缩被明显抑制，而荷叶水煎剂对该抑制无缓解作用，说明荷叶水煎剂对一氧化氮神经元的作用无影响。

Cajal肌内间质细胞（Intramuscular interstitial cells of Cajal，ICC-IM）中钙激活的氯离子通道蛋白1（Anoctamin，Ano1）是胃肠运动的基础。Ano1的缺失会引起Ca2+瞬变和慢波持续时间缩短，导致胃肠收缩减弱[12]。胆碱能神经纤维紧贴ICC-IM，胆碱能纤维末梢释放乙酰胆碱，可激活ICC-IM的M受体，引起Ano1激活，Cl-外流。Sung TS等发现胆碱能神经传递能加强Ca2+瞬变[15]，表明ICCIM是胆碱能神经传递的主要介质。乙酰胆碱可通过激动肠平滑肌上M受体使胞内三磷酸肌醇和二酰基甘油浓度上升，促使Ca2+释放和底物蛋白磷酸化，从而增加小肠平滑肌的收缩幅度、收缩力及蠕动。阿托品为竞争性M受体阻断药，可阻断乙酰胆碱与受体结合，从而拮抗其对M受体的激动效应。本文结果显示加入阿托品后，家兔离体小肠平滑肌收缩力降低，再加入荷叶水煎剂后小肠平滑肌收缩力增强，说明荷叶水煎剂可以增强乙酰胆碱的作用，改善阿托品对乙酰胆碱的对抗作用；但其是否通过兴奋M受体，还是通过兴奋胆碱能神经纤维发挥作用，还需要进一步研究。

综上所述，荷叶水煎剂能增强家兔小肠平滑肌的运动，其机制主要是与乙酰胆碱对肠平滑肌上M受体作用增强有关。