II 型CRISPR 系统在微生物中的应用

2023-01-12田艾迪刘瑛陈叶平史海粟岳喜庆武俊瑞洛雪

中国食品学报 2022年12期

田艾迪，刘瑛，陈叶平，史海粟，岳喜庆，武俊瑞，洛雪

（沈阳农业大学食品学院沈阳 110866）

CRISPR/Cas 系统是由成簇的，具有规律间隔的短回文重复序列以及多种CRISPR 相关基因构成的一种细菌的免疫系统。约40%细菌和90%古细菌中都存在CRISPR/Cas 系统[1]。CRISPR/Cas 系统包含重复间隔单元和多种Cas 基因，细胞通过识别Cas 基因编码的蛋白进行免疫反应，对进入细胞的外源DNA 进行切割来保护自身[2]。

CRISPR/Cas 系统根据Cas 蛋白的结构和功能分为三大类型，包含10 个亚型，6 个Ⅰ型，2 个Ⅱ型和2 个Ⅲ型。其中，I 型和Ⅲ型CRISPR/Cas 系统需要多种CRISPR 相关蛋白（Cas 蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ型系统只需要一种Cas 蛋白即可，因此Ⅱ型CRISPR 系统应用最为广泛[3-4]。

2013 年2 月，洛杉矶学者们首次发现CRISPR/Cas 系统[5]。此后，因CRISPR/Cas 系统具有操作简便，适用范围广，时间短，单个基因的编辑效率高等优势，近年在不同物种中得以发展应用[6]。目前研究人员己成功利用CRISPR/Cas9 系统对斑马鱼[7-8]、大鼠[9]、山羊[10]、大豆[11]、水稻[12]、烟草[13]、芽孢杆菌[14]、酵母菌[3]、大肠杆菌[15]、乳酸菌[16]、拟南芥[17]等物种进行基因敲除。研究人员在CRISPR/Cas 系统的基础上研发了CRISPR Interference 系统，发现该系统能够仅在mRNA 的层面上进行基因调控，目前细菌CRISPRi 系统已发展较为成熟[18]。本文主要综述CRISPR/Cas9 系统及CRISPRi 系统近年来在芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等生物的应用。

1 II 型CRISPR 系统的原理

Ⅱ型CRISPR 系统包括CRISPR/Cas9 系统、CRISPRi 系统和CRISPRa系统，CRISPR/Cas9 系统的工作原理如图1 所示。

图1 CRISPR/Cas9 系统原理Fig.1 Principle of the CRISPR/Cas9 system

CRISPR/Cas9 系统是crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracr RNA（trans-activating RNA）结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在PAM 序列位点处与其结合，形成RNA-DNA 复合物，进而对DNA 双链进行切割形成双链断裂（double-strand break，DSB）[19-20]。随后激活细胞内的免疫反应，对相应基因进行切割，进而达到使靶向基因失活的目的[21]。目前该系统主要是通过人工设计这两种RNA，形成具有引导作用的sgRNA（single guide RNA），引导Cas9 蛋白对DNA 进行定点切割，从而引起细胞内DNA 修复机制的启动[22-23]。

当使用Ⅱ型CRISPR 系统时，对于基因组中产生的DSB，细菌自身会通过两种途径进行修复，一种是非同源末端链接（non-homologous end joining，NHEJ）途径，一种是基于同源DNA 片段的同源重组（homology-directed repair，HDR）途径[24]。

NHEJ 途径可以通过以现有的碱基为原料进行双链两端的修复，可能会对核苷酸产生改变。HDR 途径利用断裂位点两端的同源片段为模板，进行修复，原理如图2 所示。

图2 基因修复原理Fig.2 Principle of gene repair

这两种修复模式扩大了CRISPR/Cas9 系统的适用范围，使得CRISPR/Cas 系统既可以利用NHEJ 途径对基因进行定向失活，也可以利用HDR 途径敲入新基因或者定向替换[25-26]。CRISPRi的原理如图3 所示，首先使Cas9 蛋白的氨基酸序列发生（D10A/H840A）突变，使HNH 和RuvC 两个核酸内切酶活性位点失活，得到催化失活的Cas9（dCas9）蛋白，该蛋白虽不能切割双链DNA，但可与DNA 双链结合。在gRNA 介导下，dCas9 蛋白与位点结合后，能够阻碍RNA 聚合酶的通过，有效地抑制下游基因的转录[27]。

图3 CRISPRi 系统原理Fig.3 Principle of the CRISPRi system

2 II 型CRISPR 系统在大肠杆菌中的应用

大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性菌模式微生物，因具有遗传背景清晰，代谢途径大多已探明，生长速度快，容易进行大规模培养等优点，而通常被选作研究基因的载体。早在2011 年，Rimantas 等[28]就发现CRISPR/Cas 系统可能起到移动基因盒的作用，可以克服遥远物种之间的障碍。于是，研究人员根据大肠杆菌的这些特点与CRISPR 系统相结合，进行一些探索。

2.1 CRISPR/Cas9 系统在大肠杆菌中的应用

大肠杆菌是一种在自然界分布广泛的条件性致病菌，在正常情况下不具有致病性，是人和动物正常的肠道菌群，常作为模式菌种在工业生产中使用。研究人员为了提高大肠杆菌在工业上的利用率，利用CRISPR 系统对大肠杆菌进行相应的改造。Tan 等[29]利用CRISPR/Cas9 系统，通过对TE10 表达、培养基pH 值和C/N 比等条件进行优化，提高了Fab 基因的表达，调节大肠杆菌中的相关代谢网络，最终菌株的生物辛酸产量与野生型相比提高了82%，且能在最低限度的培养基中生产辛酸。王钦[30]利用CRISPR/Cas9 系统对大肠杆菌进行单基因乃至多基因的敲除，确定对L-酪氨酸产量和转化率提高最有效的改造策略，最终得到的菌株L-酪氨酸产量较原始菌株提高了87.2%。

CRISPR/Cas9 系统具有良好的兼容性，能与其它技术共同使用，对大肠杆菌进一步改良。王茹[31]将CRISPR/Cas9 系统与常压室温等离子体诱变技术相结合，敲除了cdd 基因和poxB 基因，阻断大肠杆菌的胞苷降解途径，减弱乙酸合成途径，达到改造胞苷代谢网络的目的，得到的最终菌株葡萄糖的消耗速率是原始菌株的82.78%和88.3%，胞苷浓度是原始菌株的1.10 倍和1.25 倍，糖苷转化率提高了30.95%和41.18%，最终有效提高大肠杆菌的胞苷产量。然而，由于大肠杆菌中直接应用CRISPR 系统时存在转化效率低、质粒不稳定等问题，于是研究人员又对大肠杆菌进行二次改造，得到转化效率更高，更适宜工业生产的菌株，如Wang 等[32]利用CRISPR/Cas9 系统对大肠杆菌MG1655 基因组的一系列位点进行遗传修饰，使MCRA、endA 和recA 基因失活，最终转化效率提高168 倍，获得1 株具有较高转化效率和质粒稳定性的健壮、通用的宿主菌株JW128，该菌株在引入相应的合成途径后，生产所需化学物质。

研究人员发现在大肠杆菌中存在部分血清型大肠杆菌，具有致病性且多发现于被污染的食物中，根据临床特点、发病机制以及流行病学等特征分为肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠黏附性大肠杆菌等5 种类型[33]。当人类感染这些致病性大肠杆菌后，易引起腹泻，严重者甚至会危及生命[34]。研究人员目前的研究重点是探索如何降低毒素型大肠杆菌的毒力。檀克勤等[35]利用CRISPR/Cas9系统和λ-RED 级联的敲除技术共同构建缺陷菌株，探讨ETEC K88 基因在产肠毒素大肠杆菌中发挥的作用。富国文等[36]利用CRISPR/Cas9 系统对大肠埃希氏菌的Irp2 基因进行敲除，发现菌株的致病力有所降低，其作用机制尚未明确。

综上所述，研究人员对于非致病性大肠杆菌的研究通常是利用CRISPR/Cas9 系统敲除或修饰对相应的基因，改变代谢通路，提高相关产物的合成能力，得到更多的代谢产物。在致病性大肠杆菌的研究中，通过对致病基因进行敲除，或对致病基因产物参与的通路进行阻断，最终降低大肠杆菌的毒力。

2.2 CRISPR/Cas9 系统在大肠杆菌中的其它应用

基于CRISPR/Cas9系统，CRISPR/Cas9的核糖核蛋白（RNP）复合物是一种具有多种生物医学应用前景的生物工具。目前仍面临产率低，核酸酶活性时间短等问题。针对这些问题，研究者对Cas9蛋白的生产方法进行了优化。Qiao 等[37]提出一种简化的方法，通过共表达Cas9 和靶向特异性的单引导RNA，从大肠杆菌中直接生产Cas9 RNPs。利用CL7/Im7 纯化技术，实现了包括常用的Cas9和Cas12a 在内的自组装CRISPR/Cas RNPs 的一步纯化，产率比现有方法提高约4 倍。由此建立了一个成本低、耗时短的生产CRISPR/Cas RNP 的平台，提高了Cas 蛋白的产率。面对核酸酶活性时间短的问题，研究者一直在努力实现对Cas9 核酸酶活性的时间控制，进而解决这个问题。Iwasaki等[38]开发了一种连接物，将茶碱和3 甲基黄嘌呤（3MX）结合的适体与sgRNA 结合，使大肠杆菌能够进行小分子依赖性编辑。这些可激活的引导RNA 能够实现体内基因编辑的时间和转录后控制。此外，它们还减少了基因组切割引起的宿主细胞死亡，解除了CRISPR 介导的细菌重组工程的限制，使大肠杆菌的应用更为广泛。

近年来因抗生素的滥用，故大肠杆菌的耐药性问题逐渐引起人们的关注。有研究表明CRISPR-Cas 系统与基因转移有关，能帮助细菌适应外部环境。目前二者的关系尚未明确，于是一些研究人员通过CRISPR-Cas9 系统来探究与耐药性相关的基因。李琳等[39]和赵霞[40]通过CRISPR 系统调查发现鸡源大肠杆菌中广泛存在CRISPR 系统且大肠杆菌的CRISPR 还与多重耐药表型相关。然而，多重耐药株Cas 蛋白表达差异不显著，提示Cas 蛋白的表达可能与大肠杆菌耐药性不相关，相关部分有待探究。

研究人员根据CRISPR 系统与细菌之间的关系，探究其能否消除耐药性，这是利用CRISPR 系统能够特异性识别靶基因并将其切割消除的能力。利用噬菌体将CRISPR 系统相关基因注入细菌内，通过CRISPR 系统切割靶质粒，导致质粒丢失，使得细菌恢复对药物的敏感性[41]。李培思等[24]利用这个方法建立了一种单质粒介导靶向mcr-1基因的CRISPR-Cas9 系统，该系统能够特异性消除黏菌素耐药大肠杆菌中的mcr-1 基因，恢复对黏菌素的敏感性。Otoupal 等[42]利用CRISPR/Cas9系统开发了一种被称为有机体适应受控障碍的方法，系统地干扰基因在大肠杆菌中的表达，结果发现负上位性多肽核酸干扰增加了临床分离的碳青霉烯耐药大肠杆菌的抗生素敏感性。提示一种新的治疗策略，以限制抗生素耐药性的演变。这些方法证明CRISPR 系统能够解决大肠杆菌耐药性的问题，为后续研究提供了新思路。

2.3 CRISPRi 系统在大肠杆菌中的应用

CRISPRi 系统能抑制指定目标的编码或非编码的DNA 片段的转录。它是利用催化失活的Cas9（dCas9）能够到达引导RNA 指定的位点，而不能剪切DNA，当dCas9 结合到基因组时阻断转录机器的结合，阻止反应的进行。于是，研究人员利用CRISPRi 系统对大肠杆菌的代谢通路进行改造，以期提升相关产物的产量。Liu 等[43]以大肠杆菌W3110 为目标菌生产L-高丝氨酸，通过敲除META（编码高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶）和ThrB（编码高丝氨酸激酶），加强运输以及删除ICLR（编码异柠檬酸裂解酶调节因子）等来重定向碳流，提高了L-高丝氨酸的产量，最高效价达37.57 g/L，合理整合了葡萄糖吸收和L-谷氨酸的回收。达到提升产物产量的目的。

CRISPRi 系统也用于改造工业菌株，提高产量等方面。4-羟基苯乙酸（4HPAA）是合成药物、农药和生物化工的一种重要原料，NADPH 和ATP等辅因子在4HPAA 生物合成中起重要作用。为了提高4HPAA 的产量，Shen 等[44]开发了一种新的基于CRISPRi 系统的工程策略（CECRiS）。该策略使大肠杆菌中消耗NADPH 和ATP 的所有酶编码基因被抑制。其中，NADPH 消耗酶编码基因yahk和ATP 消耗酶编码基因fees 的缺失，使4HPAA的产量从6.32 g/L 增到7.76 g/L；又利用EsaPESAS 群体感应抑制系统自动下调PABA 基因的表达，进一步提高4HPAA 的产量，最终得到的菌株在2 L 生物反应器中，经补料分批发酵，4HPAA 产量为28.57 g/L，产率为27.64%。效价和得率能达到目前的最高值。

CRISPRi 系统作为一种新兴工具，可用其对菌株进行联合筛查。Stefano 等[45]利用CRISPRi 系统对7 177 个菌株进行联合筛查，发现新陈代谢可缓冲健康缺陷，并阐明3 种基因特异性的缓冲机制，即：鸟氨酸通过增加CarAB 的活性来缓冲对CarAB 的抑制，S-腺苷蛋氨酸通过降低蛋氨酸途径的表达来缓冲同型半胱氨酸转甲基酶（MEE）的抑制，6-磷酸葡萄糖酸通过抑制6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的表达来缓冲对6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶）的抑制。CRISPRi 筛查可以揭示代谢稳健性的全球来源，识别缓冲特定酶减少的局部调节机制。综上，CRISPRi 系统作为新兴技术，在大肠杆菌中的应用较为深入，然而，与发现较早的CRISPR/Cas9 系统相比，仍有较大的发展空间。

3 II 型CRISPR 系统在乳酸菌中的应用

3.1 CRISPR/Cas9 系统在乳酸菌中的应用

乳酸菌是一类与人类身体健康密切相连的微生物，广泛存在于人体肠道。然而，乳酸菌中CRISPR 系统的应用并不多，原因是乳酸菌作为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，遗传转化困难，目前发现的可用抗生素和载体较少，转化效率较低，因此CRISPR 系统在乳酸菌中的应用受到限制。目前大部分针对乳酸菌中的基因编辑的研究停留在初级阶段。祁敏[16]建立了用于植物乳杆菌WCFS1 的CRISPR -Cas9 系统，优化了Cas 蛋白和质粒，为乳酸菌的CRISPR 系统提供一些思路。Yang 等[46]对NCBI GenBank 数据库中的68 株干酪乳杆菌进行研究，发现所有的直接重复序列能形成很好的RNA 二级结构，而且大量的CRISPR 间隔区与噬菌体和质粒序列有很好的同源性。Jia 等[47]首次预测在黏液乳杆菌中有完整的EPS 操纵子，并发现了IIIA 型CRISPR-Cas 系统。Anderson 等[48]对加瑟氏菌的CRISPR-Cas9 系统进行鉴定，发现它在无细胞裂解试验中有适度的活性，表明了它们移植到真核生物中作为基因编辑工具的重要性。Brandt 等[49]使用模式菌株DSM 20052 作为该物种的典型代表来描述发酵乳杆菌的基因组特征，揭示9 个分支的遗传多样性，内容可变，包括可移动的遗传元件、CRISPR-CAS 免疫系统和基因组岛以及大量的基因组重排。其在72%的基因组中发现I、II 和III 型CRISPR-Cas 系统高频率出现，具有高度的菌株变异性。CRISPR/Cas9 系统在不同乳酸菌中的应用，大多停留在发现阶段，并未得到很好的利用。

针对CRISPR/Cas9 在乳酸菌中的转化效率低的问题，Ding 等[50]发现化脓性链球菌Cas9 融合了高迁移率组蛋白HMGN1 和HMGB1、组蛋白H1 和染色质调节肽（CMPS）3 类蛋白，可将化脓性链球菌Cas9 蛋白的活性提高数倍，在多个目标的情况下优势更为突出，如在12 个目标中甚至提高5 倍。进一步试验发现CMP 融合策略也能有效提高其它Cas9 核酸酶的活性。这项研究为Cas9基因修饰提供了新的方法。

目前的CRISPR 系统直接在乳酸菌中应用的案例较少。Production 等[51]在植物乳杆菌WCFS1中建立了CRISPR/Cas9 辅助的双链DNA（DsDNA）和单链DNA（SsDNA）重组工程，成功地在植物乳杆菌中敲除了NAGB 基因，进而消除6-磷酸果糖（F6P）与6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6P）的反向反应。在glmS1 基因中引入核糖开关替换和点突变来缓解反馈抑制，最终使得工程菌以葡萄糖为唯一碳源，生产797.3 mg/L 的GlcNAc。

乳酸菌不仅存在于自然界中，还存在于人体中。对于在人体中的乳酸菌来说，需克服噬菌体带来的威胁，人们发现口腔中的加瑟氏乳杆菌为了克服噬菌体捕食带来的影响而产生几种防御系统，其中就包括CRISPR/Cas9 系统。虽然乳酸菌中具有多种CRISPR 系统，但是MGES 偶尔可以逃脱CRISPR-CAS 系统的定位。于是，Stout 等[52]利用质粒干扰试验研究了CRISPR-CAS 的靶向和逃逸机制，这项研究将有助于更好地理解II 型CRISPR-CAS 系统偶尔失败的原因，更好地实现CRISPR 系统在乳酸菌中的应用。

总体而言，CRISPR/Cas9 系统在乳酸菌中的使用仍处于起步阶段，面临许多问题。

3.2 CRISPRi 系统在乳酸菌中的应用

CRISPRi 系统作为新兴技术，在乳酸菌中的应用并不多见，仅有少数研究作为参考。Myrbraten等[53]利用CRISPRi 系统敲除植物乳杆菌中的基因。在双质粒系统中，将dCas9 和sgRNA 分别在不同的质粒上表达，发现可有效抑制任何目的基因的表达，了解了植物乳杆菌细胞周期关键基因的功能。Crawley 等[54]对1 262 个已公开的乳酸菌基因组进行采样，发现它们富含CRISPR-Cas 适应性免疫。然而，II-A 型系统在其天然宿主中是自然活跃的，能够表达并有效靶向侵袭性DNA 和基因组DNA。这些系统增加了Cas9 的靶向空间，并在本地宿主和异源基因组编辑目的中提供更多的可能，提高了CRISPR 系统在乳酸菌中使用的可能性。田开仁等[55]利用CRISPRi 系统，构建用于基因筛选以及基因功能验证的CRISPRi 系统，并验证其在乳酸乳球菌F44 中的作用，发现当sgRNA在靶向nisA 基因编码链中的D1 位置时，基因转录量仅为原始菌株的一半，表明乳酸乳球菌中CRISPRi 系统的成功构建并能对细胞中的特定基因进行转录调控。同年，Berlec 等[56]在乳酸乳球菌中开发了一种新型质粒，该质粒使两种重组蛋白在乳酸乳杆菌中共表达，并通过模型蛋白的表达来评估重组蛋白的有效性。

Kong 等[57]证明了CRISPRi 系统具有在浓度梯度中微调、增量基因调控的潜力。这项研究中，研究人员利用CRISPRi 系统开发一种新的微流控平台，使细胞暴露在浓度梯度的代谢物中，加入琼脂糖膜作为休眠底物，加上一个温度控制的环境小室，可以在稳定的生长或抑制条件下培养细胞超过10 h。这项研究证实当CRISPRi 系统与一些低成本的工程工具（如利用双面胶带、透明膜、琼脂糖膜和盖片制作的三维成像设备，）结合使用时，有助于发现新的抗生素敏感性的决定因素，具有在浓度梯度中微调、增量基因调控的潜力，并能够评估抗生素在细菌培养中的长期有效性。这项研究为CRISPRi 系统开启了一个新的应用方向。

综上，CRISPRi 系统已被证实可应用于乳酸菌的基因编辑中，然而目前的应用较少。

4 II 型CRISPR 系统在芽孢杆菌中的应用

芽孢杆菌是一种生长快，发酵周期短且易于培养的菌种，与其它原核细菌相比，芽孢杆菌有较强的分泌表达能力，能有效避免细胞内蛋白质的积累和不溶性包涵体的形成，而且芽孢杆菌的遗传背景清晰，具有开发成细胞工厂的潜力。鉴于CRISPR 系统在基因工程领域中的作用，研究人员将其用于芽孢杆菌中[58]。Marcus 等[59]就利用Inscripta（CO）发布的一种的CRISPR 核酸酶MAD7在枯草芽孢杆菌中进行基因编辑，证实了基于CRISPR 的编辑模式可在枯草芽孢杆菌中应用。

4.1 CRISPR/Cas9 系统在芽孢杆菌中的应用

CRISPR/Cas9 系统作为一种新型的基因敲除工具，在芽孢杆菌中的利用，能够提高芽孢杆菌在逆境中的抗性，或者通过对其代谢通路中的相关基因进行工业化改良，使该菌更适用于工业生产。García 等[60]通过删除在产孢过程中起重要作用的spoIIAC 基因，并利用双质粒策略，使新培育的枯草芽孢杆菌菌株从表达htp 蛋白快速转变为生产htp 蛋白，最终验证了CRISPR 工具的有效性。檀瑞婷[61]利用CRISPR/Cas9 系统对枯草芽孢杆菌进行改良，将来源于嗜热菌的伴侣蛋白基因插入宿主中，与伴侣蛋白Pfefoldinγ 和PPlase 的基因分别结合，得到的重组菌胞外酶活较初始酶活提升约7.94 倍和8.55 倍。再结合超高温酶的相关特性进行发酵条件的优化，最终得到菌株的胞外酶活较初始酶活提高约71.08 倍，有效提升了α-淀粉酶的产量和抗性。李由然等[62]利用CRISPR/Cas9系统对枯草芽孢杆菌进行改良，将来源于嗜热菌的伴侣蛋白基因插入宿主中，与伴侣蛋白Pfefoldinγ 和PPlase 的基因分别结合，得到的重组菌胞外酶活较初始酶活提升约7.94 倍和8.55 倍。再结合超高温酶的相关特性进行发酵条件的优化，最终菌株的胞外酶活较初始酶活提高约71.08 倍，有效提升了α-淀粉酶的产量和抗性。李由然等[63]构建了诱导型表达Cas9 蛋白的重组质粒，成功实现了地衣芽孢杆菌淀粉酶编码基因amy L 的敲除，为改造发酵地衣芽孢杆菌提供了新的方向。

随着人们生活水平的提高，绿色食品的概念逐渐深入人心，生物农药成为一种常见的化学农药替代品。苏云金芽孢杆菌为一种生物农药，在产生芽孢过程中产生一种杀虫蛋白，当害虫取食含有该细菌的食物时，该菌能够在害虫的肠道内产生内源毒素和外源毒素，最终达到杀虫的效果。然而，随着这款农药的使用，一些害虫对其产生抗药性，因此，研究人员利用CRISPR/Cas9 系统对苏云金芽孢杆菌进行改良，来消减这种抗药性。Wang等[64]利用CRISPR/Cas9 介导的基因敲除来测试APNs 在Bt 毒素表达过程中的作用。Wang 等[65]也通过CRISPR/Cas9 方法成功获得1 株ABCC2 缺失突变的纯合菌株（OfC2-KO）。敲除菌株OfC2-KO 对Cry1Fa 的抗性超过300 倍，对Cry1Ab 和Cry1Ac 的抗性较低（＜10 倍），而对Cry1Aa 和两种化学杀虫剂（阿维菌素和氯氰异丙醇）的毒力没有显著影响。

CRISPR/Cas9 系统有利于提高苏云金芽孢杆菌中杀虫蛋白的应用，提高杀虫效果。

4.2 CRISPRi 系统在芽孢杆菌中的应用

CRISPRi 系统作为一种新型的基因工具，在研究下调基因的方面有良好的效果，CRISPRi 系统应用于枯草芽孢杆菌中取得一定成果。早在2016 年，Zhao 等[66]就利用CRISPRi 系统证明脂质循环中两种UPP 磷酸酶的冗余。

2018 年Wu 等[67]开发了一个基于木糖诱导的CRISPRi 的枯草芽孢杆菌基因抑制系统，目的是下调3 个基因（zwf，pfkA，glmM）的表达，这3 个基因控制GlcNAc 合成的主要竞争反应[戊糖磷酸途径（HMP）、糖酵解和肽聚糖合成途径（PSP）]，实现葡萄糖和木糖的共同利用。通过CRISPRi 同时抑制这3 个基因，使GlcNAc 滴度提高了13.2%，达（17.4±0.47）g/L，其中葡萄糖和木糖的产量提高了84.1%，达（0.42±0.036）g/g。为进一步实现葡萄糖和木糖的协同利用，针对这3 个基因的不同sgRNA 阵列，建立一种组合方法。对发酵体系的时间控制进行优化，发现接种6 h 后添加15g/L 木糖，菌株BNX122 在摇瓶培养条件下可合成（20.5±0.85）g/L 的葡萄糖和木糖，产量为（0.46±0.010）g/g葡萄糖和木糖。这些发现表明，CRISPRi 激活的调控方法为促进微生物细胞工厂协同利用多种碳源提供了一种简单、高效和通用的方法。

2019 年，Wang 等[68]利用CRISPRi 系统，通过抑制氨基酸合成分支代谢途径上的基因，提高枯草芽孢杆菌表面活性物质的产量，从氨基酸的分支代谢途径中筛选出20 个基因进行单基因CRISPRi 抑制，在得到的重组菌株中，有16 株获得较高的表面蛋白产量。其中yrpC、RACE 和MurC3 株菌株表现最为明显，其表面蛋白产量分别提高到0.54，0.41g/L 和0.42g/L。之后，又对3 个基因进行多基因抑制，构建了yrpC 和RACE、yrpC和MurC 或RACE 和MurC 的双基因敲除菌株，使表面素产量分别增到0.75，0.57 g/L 和0.48 g/L，提高了产量。

CRISPRi 系统作为一种新型基因干扰技术，在芽孢杆菌中取得一定成果。

5 II 型CRISPR 系统在其它细菌中的应用

5.1 CRISPR/Cas9 系统在其它细菌中的应用

CRISPR/Cas9 系统因具有效率高，操作简便等特点，在微生物研究中得到广泛应用。球菌、梭菌、弧菌等是自然界中常见的细菌种类，在工业生产中应用广泛。研究人员利用CRISPR/Cas9 系统对这些细菌进行改良，来适应社会生产的需要。Tan 等[69]在不影响靶标效率的情况下，利用CRISPR/Cas9 系统在具有高度特异性全基因组活性的人类细胞中设计一种基于测序（GUIDESEQ）方法和定向深度测序分析的双链断裂识别SaCas9 的工程变体，这极大地提高了全基因组靶向的准确性。陈相好等[70]成功在艰难梭菌中构建了rsb V（编码anti-anti-sigma 因子）、rsb W（编码anti-sigma 因子）及sig B 基因（编码sigma-B因子）的CRISPR-Cas9 敲除载体。张大炜等[71]应用CRISPR/Cas9 系统对艰难梭菌的主要毒力因子tcdB 基因进行切割，最终达到特异性抑制致病艰难梭菌生长的效果。刘永等[72]在红色糖多孢菌基因组中应用CRISPR/Cas9 系统，在工业菌株Ab（HP）中敲除eryBGC 基因，阻断了红霉素的生物合成，激活红色糖多孢菌中原有的沉默生物合成基因簇，重构次级代谢途径，使红霉素产量增加，最终构建了有效的红色糖多孢菌的CRISPR/Cas9的基因编辑系统，提高了红霉素的产量。尹畅等[73]以裂殖壶菌为研究对象，构建了相应CRISPR/Cas9 基因编辑系统，对裂殖壶菌中与脂肪酸合成相关的基因进行敲除，并替换为Zeocin 抗性基因片段，说明Pks D 基因的敲除影响脂肪酸的合成。

综上所述，CRISPR/Cas9 系统具有适用范围广，操作简单等优势，在很多细菌中都有广泛应用。

5.2 CRISPRi 系统在其它细菌中的应用

CRISPRi 系统是由CRISPR/Cas9 系统中发展而来，具有CRISPR/Cas9 系统应用范围广，操作简单等优点。Tan 等[74]建立了针对假单胞菌（Pseudomonas spp.）基因抑制的CRISPRi 系统，发现另外两个PAM 位点NNGCGA 和NNGTAA，扩大了巴氏杆菌dCas9 的可能靶标数量。刘永等[72]在CRISPR/Cas9 系统应用的基础上用CRISPRi 系统干扰基因表达。利用定点突变的dCas9 构建的CRISPRi 系统抑制靶基因的表达，结合温度调控的抑制强度，使红霉素产量增加。运动发酵单胞菌是一种很有前途的生物燃料生产菌种，它能高效将糖转化为乙醇且，具有很高的酒精耐受性。Amy等[75]通过靶向在细菌中普遍保守的必需基因，来证明运动链球菌中CRISPRi 系统的有效性。最终确定运动发酵单胞菌与生长、糖发酵成乙醇和异丁醇抗性有关的基因特征。建立的Zmobilis CRISPRi 系统可直接定义基因功能，并可应用于改进菌种工程和提高生物燃料产量，为合理设计产量更高的生物燃料生产菌株开辟一条道路。

据目前研究现状，基因的传递条件限制了CRISPRi 靶向基因表达的能力。现有构建的传递物太大，不适合一些病毒的包装。研究人员对CRISPRi 组分进行优化，生成一个包含所有功能元件的单一AAV 载体，并有效下调了内源基因在体内的表达。Jon 等[76]利用螺旋接头和c-Myc 核定位信号，将失活的金黄色葡萄球菌Cas9（SadCas9）的核靶向性提高4 倍。之后，发现氨基末端Krüppel 关联盒（KRAB）在体外有效降低靶基因的表达。最后，优化了GUIDE RNA 的启动子，并对KRAB-SadCas9 在肝细胞中表达的微型启动子进行评价。构建的重组质粒在体外可使（PCSK9）mRNA 和分泌蛋白减少5 倍。相应的AAV2/8 载体定位于肝细胞核内，体内PCSK9mRNA 和血清蛋白水平降低30%。

在最近的研究中，研究人员开始研究抗CRISPR 系统，该系统对水平基因的转移起到一定的促进作用。研究的主要方向是ACRs，它是一种能抑制RNA 引导的CRISPR-Cas 酶的DNA 靶向活性的小蛋白。ACRs 由噬菌体和噬菌体衍生的细菌基因编码，可以阻止CRISPR 介导的噬菌体感染抑制，也可阻止CRISPR-Cas 介导的真核细胞基因组编辑。Watters 等[77]为了鉴定能够抑制金黄色葡萄球菌Cas9（SauCas9）的ACR，使用自靶CRISPR 筛选和内疚关联基因组搜索的策略。结果证实了一种新的发现ACR 的方法，并将AcrIIA13-AcrIIA15 确立为SauCas9 的独特双功能抑制剂。

利用CRISPRi 系统，能够对细菌的代谢通路做出一些调整，增加需求物质产量，具有操作简便，应用范围广的优点。

6 CRISPR 系统在酵母菌中的应用

6.1 CRISPR/Cas9 系统在酵母菌中的应用

利用CRISPR/Cas9 系统对于酵母的研究主要集中在两个方面：1）从基础代谢等方面与CRISPR系统相结合并进行改良。2）结合CRISPR 系统对现有菌种进行改良，提高相关产品产量。

酵母菌作为一种常用的真菌型模式微生物，具有完整的细胞内膜系统，对于一些体内物质合成（如萜类物质等）具有明显优势，常用来作为底盘宿主。其中，酿酒酵母是在工业中运用广泛的菌种。路曼等[78]利用CRISPR-Cas9 系统在酿酒酵母中抑制了IDH2 和PGII 两个基因，提高了脂肪酸通路中乙酰辅酶A 以及NADPH 的供应量，得到的最佳工程菌的脂肪酸产率相较于原始菌株提高了22%。利用CRISPR/Cas9 系统在删除了合成磷脂酶途径、磷脂走向三酰基甘油途径、脂肪酸分解代谢的β 氧化途径和促进甾醇合成途径中的关键酶基因后，使碳流向脂肪酸的合成和积累路径发生改变，从而增加了脂肪酸的产量。酵母菌具有完整的细胞内膜系统，有利于对酵母细胞中的基因功能进行判断，也同样适合代谢通路的研究。陆海燕等[79]利用CRISPR-Cas9 系统对安琪酵母工业菌株衍生菌株K-a 进行基因修饰，失活靶向基因，得到的目的菌株比例高达74.4%。初步建立了适于利用CRISPR/Cas9 系统进行基因修饰的工业菌株宿主平台和相应的基因修饰的操作系统流程。贠小芸[80]用CRISPR/Cas9 系统对酿酒酵母WAT11 内源MVA 途径的萜类通路相关基因tHMGR1、ERG20、ERG9、BTS1 进行调控，利用角鲨烯作为标志物，引入肠沙门氏菌乙酰辅酶A 合成酶基因SeACSL641P、大肠杆菌IDI1 基因、枯草芽孢杆菌IDI2 基因，进而观察酿酒酵母细胞内的萜类化合物代谢流向，找出最优菌株，成功构建高效合成α-香树脂醇（α-amyrin）的酵母工程菌，为α-香树脂醇以及其衍生物的生物合成奠定基础，也为后期CYPs、UTGs 的功能鉴定搭建了平台。谢文娟等[81]利用CRISPR/Cas9 系统，通过改造代谢工程，减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）的形成，提高了其构造的酿酒酵母工业化应用的可能性。这些研究都是利用CRISPR/Cas9 系统对相关基因进行敲除，进而影响酵母菌的代谢通路来对酵母进行改良。酵母菌作为一种工业用模式菌株，当人们对新产品产生需求时，采用CRISPR 系统对酵母菌株进行改造，得到新型的酵母菌株。李梦琦等[82]在Lager 型啤酒酵母中构建CRISPR-Cas9 基因敲除系统。Zool 等[83]从油棕榈堆肥中分离到1 株能利用长链脂肪酸为唯一碳源的脂肪分解酵母Candida aaseri SH14。之后，利用CRISPR-Cas9 系统构建一个遗传操作系统，开发该菌株作为以可再生植物油为原料生产生物基化学品的平台酵母。利用CRISPR-CAS9 系统，效率达到60%，最终证明这一基因组工程工具可以加速红曲霉SH14 的工业化应用。陈红[84]利用CRISPR 系统敲除了己糖激酶同工酶2，降低了酿酒酵母对果糖的代谢，成功实现以酿酒酵母为宿主，以果糖为底物，高附加值D-阿洛糖的生产。刘磊等[85]利用CRISPR/Cas9 系统敲除了酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因（gpd2），甘油和2，3-丁二醇产量下降，乙醇产量提高。为进一步探究酿酒酵母其它代谢产物与2，3-丁二醇合成之间的关系具有借鉴意义。基于对美好环境的需求，人们倡导绿色能源，生物燃油成为人们的研究热点。研究人员利用酵母和CRISPR系统的结合，对生物燃油进行了研究。黄河浪等[86]利用CRISPR 系统在酿酒酵母中导入植物乳杆菌的阿拉伯糖代谢途径，构建1 株能有效利用阿拉伯糖并能将木糖转化为木糖醇的重组酿酒酵母菌株KAX3-2，为以秸秆等木质纤维素类生物质为原料生产液体生物燃料——乙醇的研究提供了一些参考。如Li 等[87]利用CRISPR 系统和耐压酵母创建一个带有重构莽草酸途径的菌株文库，用于生物合成2-PE。CRISPR/Cas9 系统对单个基因的敲除十分方便、快捷，然而，同时对多个基因进行靶向敲除，步骤繁琐，效率降低。研究人员对系统进行了改进，如汪娟[88]利用CRISPR/Cas9 系统构建新的gRNA-tRNA 阵列CRISPR 系统（gRNAtRNA-array Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9），简称GTR-CRISPR，该系统可快速实现酿酒酵母对1 对多靶点基因的敲除。Zhang 等[89]利用gRNA，使GTR-CRISPR 以87%的效率同时破坏8 个基因。其还研究一种Lightning GTR-CRISPR 系统，该系统删除了在大肠杆菌中克隆的步骤。此方法将GTR-CRISPR 系统用于简化酵母脂质网络，10 d 内使游离脂肪酸的产量增加30 倍。

gRNA 的高效表达对CRISPR 系统的应用具有重要意义。这种改良的CRISPR 系统能够提高多基因编辑的效率，大大缩短了操作时间，降低操作难度。Larroude 等[90]构建6 个CRISPR/Cas9 载体，创建一套通用的、模块化的CRISPR/Cas9 载体，可快速编辑任何溶脂耶尔森氏菌菌株；该工具有助于对任何有研究意义的原生菌野生型菌株进行试验，加快了CRISPR/Cas9 系统的速率。

6.2 CRISPRi 系统在酵母菌中的应用

CRISPRi 作为以CRISPR/Cas9 为基础的基因组编辑系统，极大地促进了工业酵母菌株的基因工程。Elena 等[91]报道了一个多倍体工业酵母菌株CRISPR 激活和干扰工具箱（CRISPRa/I）的构建。在高拷贝和低拷贝变体中获得的CRISPRa/i 质粒中，dCas9 单独表达，或与激活或抑制结构域VP64、VPR 或Mxi1 融合表达。通过体内同源定向修复将sgRNA 从双链寡核苷酸导入CRISPRa/I质粒，无需克隆就可以快速转录调控新的靶基因。CRISPRa/I 工具箱的特征是荧光蛋白编码基因在两个不同启动子的作用下表达发生改变，使表达改变达到原来的2.5 倍。CRISPRa/i 工具包利用新型的基因干扰系统对酵母菌的改良是研究热点。CRISPRi 系统可广泛用于评估菌株改良的程度，进而加快对新的工业用菌株的开发与使用。