药品微生物限度检查方法适用性中存在的问题及改进建议

任颖慧 曹鲁娜 赵蕊蕊 武 玲

药品微生物限度检查是保证用药的有效性、保障药品安全性的重要措施[1]。我国开展药品微生物污染检查工作始于1972年[2]，《中华人民共和国药典》2005年版初次提出微生物限度检查方法验证，2015年版将方法验证修订为方法适用性，形成了较为完善的药品微生物控制标准体系，基本与美国药典（USP）等国际人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）方案接轨，实现了微生物限度检查由最终产品检验向过程控制的改变。方法适用性将试验条件、供试品等因素作为一个整体系统来评价，更具科学性[3-5]。由于我国方法适用性工作开展时间较短，加之在前版药典规定的方法验证基础上有大幅度修订，有些实验室在开展该项工作时对新版药典要求理解不够透彻、检验能力不足、建立的微生物限度检查方法不够规范，与标准要求还存在一定的差距。本文以笔者所在实验室2020年1月至2021年10月收集的541份药品生产企业提供的方法适用性资料为样本，对照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1105、1106和1107有关非无菌产品微生物限度检查方法的要求[6]，逐份审核企业提供的方法适用性资料，针对审核资料时发现的问题进行分类整理，结合笔者实际工作，分析其问题来源并针对性提出正确的解决方案，为推动企业规范开展方法适用性试验提供参考。

1 存在的问题及分析探讨

1.1 微生物计数法存在的问题

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数[6]。方法适用性资料中出现问题较多的是稀释液的使用、试验菌的使用、试验菌株的回收试验、抑菌活性去除等方面。

1.1.1 稀释液的使用 供试品的处理是获得良好检验结果的基础[7]。对于水溶性供试品，供试液制备时药典规定可以选用的稀释液有pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基3种，有的企业试验记录中照抄照搬药典内容，将3种稀释液罗列。正确的操作建议：每次试验应据实写明具体使用的是哪种稀释液，同时应明确标注取用量，而不能用“取适量”描述。

1.1.2 试验菌的使用 《中华人民共和国药典》2020年版四部对试验菌共有3个要求：1）试验菌株传代次数不能超过5代，且应使用新鲜培养物（黑曲霉除外）；2）所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%；3）加入试验菌液后使每毫升供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100 cfu[6]。要同时满足这3个要求，在制备菌液时应充分考虑。有的企业将试验菌液制成每毫升含菌量不大于100 cfu的菌悬液，采用平皿法制备试验菌液时取1∶10供试液10 ml，加入1 ml上述菌悬液。这样以来，所加菌液体积超过了供试液体积的1%，相当于试验菌液对供试液进行了稀释，增加了计数结果误差，降低了检测的准确度。有的企业取供试品10 g，加入稀释剂至100 ml，制成1∶10供试液，试验组直接取上述100 ml供试液加入不大于100 cfu的菌悬液1 ml，满足了所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%，但每毫升供试液含菌量不大于1 cfu，以上两种操作菌悬液含菌量过低易引入操作误差，同时菌落数分布的不均匀可能会导致试验菌无法顺利回收。第2种方法更是造成了培养基的大量浪费，因为制备的试验组混匀后仅需分注2个平皿（1 ml/皿）进行微生物培养计数。

正确的操作建议：取不超过5代的药典规定的5种试验菌株，制备成含菌量为103～104cfu/ml的菌悬液或孢子悬液，以平皿法为例，应取供试液9.9 ml，加入0.1 ml试验菌悬液[8]，同时满足了规定的3个条件，而且这种操作简单便捷，避免了培养基和试验菌悬液的浪费。采用薄膜过滤法时，每张滤膜每次冲洗量一般为100 ml，在最后一次冲洗液中加入1 ml含菌量不大于100 cfu的菌悬液，即可满足药典要求。

1.1.3 试验菌的回收试验 微生物计数方法适用性试验菌株有5种，包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，其中白色念珠菌和黑曲霉既用于需氧菌总数计数，同时用于霉菌和酵母菌总数计数，只是所用的培养基不同。资料审核中，有一家企业未对黑曲霉进行回收试验。如果操作不当，黑曲霉容易对试验环境造成污染；试验人员防护不当，黑曲霉有可能对人员造成伤害[9-10]。但这些危险因素可以通过严格的标准操作规程防范，不能成为规避标准要求的借口。

微生物限度检查是检测活的微生物，其自身处于生长、繁殖和死亡的生物代谢状态。与化学对照品含量稳定不同，试验菌液的含菌量不是固定的，因此，每一次使用时都要进行预计数，在试验时应进行同步准确计数。

1.1.4 抑菌活性的去除 方法适用性的目的是建立对样品影响更小、操作效率更高的方法[11]，存在工作量大、重复劳动过多的问题[12]，抑菌活性的去除是微生物限度检查工作的重点和难点[13]。541份方法适用性资料中，采用平皿倾注法（1∶10）的有301份；其他240份均采用了增加稀释液或培养基体积、使用中和剂、薄膜过滤法，以及上述方法的联合应用等去除抑菌活性。有的企业去除样品抑菌活性时采用增加稀释液体积（平皿倾注法1∶100供试液）进行方法适用性试验，各试验菌回收比值均在0.5～2范围内，在满足药典要求的情况下，继续采用薄膜过滤法进行试验，结果薄膜过滤法的试验结果与平皿法相差无几，最后确定的方法是平皿倾注法（1∶100）。笔者认为这种双重试验不可取。通过科学严谨的试验设计得出有效结论后，应及时予以确认，无须重新开展试验，重复性试验对人力物力都是极大的浪费。这在一定程度上表明检验人员对药典要求理解不充分。

有的企业在重新进行方法适用性试验时，直接选用高稀释级供试液、薄膜过滤法或添加中和剂等方法进行抑菌活性的去除。笔者认为每一次方法适用性试验都应该做到全面、完整，为了减少检验工作量，提高工作效率，可以借鉴以往工作经验和按照前版药典要求建立的方法适用性资料，选用回收比值低于0.5的菌株作为敏感菌株开展预试验，当预试验符合药典要求后再进行正式试验，而不宜直接略过。

正确的操作建议：设计试验方案时应遵循由简到繁，由单一到联合的原则，采取循序渐进的方式逐步开展。一般选择平皿法最低稀释级进行初筛，当回收比值符合要求时，即可对方法进行确认。当任一回收比值不在0.5～2范围时，表明样品对试验菌株有一定的抑菌活性，可采取适宜的方法去除样品抑菌活性重新开展试验。对于采取多种方法均无法去除抑菌活性的样品，表明样品不易被该类微生物污染，应结合风险评估采用回收比值最为接近的方法[11]。

1.1.5 对照试验的开展 使用中和剂时，应确认其有效性和对微生物无毒性，中和剂对照组回收比值应在0.5～2范围内[6]；在12份使用中和剂去除样品抑菌活性资料中，仅有1份设计了中和剂对照组试验。

开展方法适用性试验时，应进行阴性空白对照试验，用于监测试验过程中是否引入二次污染、试验条件是否满足药典要求，确保选定的方法具有良好的系统适用性，从而保证检验结果的准确性。一旦阴性空白对照试验出现阳性结果，表明本次试验结果无效，需要立刻启动OOS调查找出污染环节并采取纠正措施后重新进行试验。

1.2 控制菌检查法存在的问题

控制菌检查用于在规定的条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物[6]。出现问题较多是加菌方式以及耐胆盐革兰阴性菌检查中的问题。

1.2.1 加菌方式的问题 控制菌检查是将供试液和试验菌液分别加入培养基，不需将试验菌液加入供试液混匀后加入培养基。有的企业混淆了现行版药典中的微生物计数和控制菌检查加菌方式，直接将试验菌液加入供试液混匀后再加入培养基。

1.2.2 耐胆盐革兰阴性菌检查中的问题

1.2.2.1 试验菌的使用 耐胆盐革兰阴性菌泛指能够在结晶紫中性红胆盐培养基中生长的微生物，肠杆菌科的细菌、产气单胞菌属和假单胞菌属属于这一类[14]。确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌，有的企业单独使用大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，不符合药典要求。

1.2.2.2 不能准确区分定性或定量检查 如某样品为含药材原粉的固体口服制剂，按照《中华人民共和国药典》四部通则1107规定耐胆盐革兰阴性菌应进行定量检查，标准要求是“小于102cfu/g”，但企业提供的资料进行了定性检查。通则1107非无菌药品微生物限度标准是根据药品的给药途径及特性等制订，凡规定“不得检出”的应进行定性检查，凡规定“小于……”的应进行定量检查。

1.2.2.3 预培养用供试液体积过少 耐胆盐革兰阴性菌检查时，应首先对1∶10供试液进行预培养。药典对预培养的供试液体积没有明确要求，有的企业取1∶10供试液1 ml进行预培养。预培养的目的是使供试液中的微生物得以恢复，取样量应对样品具有一定代表性，供试液过少对供试品的代表性较差，可能出现假阴性结果。正确操作建议：在进行试验准备时，要为该项目预留不少于10 ml的1∶10的供试液进行预培养，然后取预培养物1 ml进行后续试验。

1.2.2.4 加入菌液进行预培养 该项检查是为了使供试品的受损细菌充分恢复但不繁殖，需要对1∶10供试液进行预培养（约2 h）。此时，不能将试验菌液加入1∶10供试液进行预培养，适宜的培养条件会导致试验菌株快速繁殖，可能产生错误的试验结果。

1.3 其他问题

1份资料中提出回收率应高于70%，为《中华人民共和国药典》2010年版药典要求，表明企业在进行方法适用性试验时没有对现行版药典进行系统学习和理解，只是简单抄写上版方法适用性材料；有4家企业提供的方法适用性资料没有单位公章，无从确认资料的有效性和可靠性；有2家企业提供的资料是企业所在地省级药品检验机构的方法适用性资料，表明企业在委托检验完成后，没有进行方法的转移和确认；541份资料中，有109份使用“常规法”“稀释法”等新版药典未收载的方法术语进行描述。

2 改进建议

2.1 提高检验人员检验能力

综上所述，可以看出大部分问题的出现源于对现行版药典要求理解不透彻，主要问题源于检验人员专业能力不足。通过对辖区内药品生产企业的调研，得知在小型药品生产企业中很少单独设置微生物检验人员岗位，大部分都是从事理化项目检验的人员兼岗开展工作。微生物常规检验主要靠人工操作，不涉及大型自动化精密仪器，基本操作容易掌握，在企业中普遍对其重视不够，实际上该项目易学难精。企业提供的培训机会少，同时检验人员自身对提升检验技术的主动性差，导致对微生物限度检查积累经验少，对标准理解不透彻、不充分。因此，企业应加强微生物检验人员的培养，组织集中培训学习理论知识，不定期开展实际操作的考核。在条件允许的情况下，建议派遣技术骨干到本级或上级药品检验机构进行系统学习，学成后在企业内部实施“传帮带”，切实掌握好微生物限度检查操作技术，建立起一支过硬的微生物检验队伍。

《中华人民共和国药典》2020年版自2020年12月30日实施以来，至今已过一年，中药制剂、化学药品的微生物计数、控制菌检查等基本沿用了2015年版的有关规定。微生物检验工作者要积极参加中国食品药品检定研究院组织的现行版药典微生物限度检查的线上线下培训班，还应加强自学，提升自身检验技术，为保障药品质量安全把好关。

2.2 增加检验工具书的配备

有些问题在《中国药品标准操作规范》中描述较为详细，比如微生物计数中的供试液制备有举例说明，但企业尤其是小型药品生产企业生产品种较少，涉及的检验项目少，对工具书的投入可能欠缺。企业可向当地药检机构借阅有关资料，各级药检机构也应主动为辖区内药品生产企业提供技术支持和技术咨询，共同致力于药品质量的提高。

2.3 准确把握微生物限度标准

对于具体品种的微生物限度标准，应结合制剂通则项下和通则1107规定确定。如橡胶膏剂在通则1107中有需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数限度要求，但在通则橡胶膏剂项下则只有对控制菌的要求：不得检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。对于方法适用性资料中没有明确标准要求但检出结果超出标准规定的，在没有公开处方来源及制法的前提下，药品检验机构一定要和药品生产企业联系确认是否含有神曲等发酵原料、是否含有未经提取的动植物来源的成分及矿物质等特殊情况，防止漏检项目、标准要求出现错误等检验差错事故的发生。建议药品生产企业在处方及制法保密的前提下，方法适用性资料中除了记录试验结果外，还应明确标注限度要求。

2.4 方法适用性试验周期

企业一般将周期确定为5年，与药典换版周期一致。541份资料中，中成药517份，占95.6%。中药制剂成分复杂，当处方来源中的药材产地、炮制方法、贮藏环境等发生变化时，企业应重新开展方法适用性试验[15]。541份资料中，均为药典换版同步进行的方法适用性试验，未见因其他因素重新开展方法适用性试验的资料。

2.5 严格规范术语使用

自2015年版药典起，仅收录了平皿法、薄膜过滤法和MPN法，没有常规法、稀释法、中和法等描述，常规法一般指使用低稀释级（1∶10供试液）进行检验，稀释法指采用增加稀释液或培养基体积的方法来去除样品抑菌活性，但业内人士不会引起误解。笔者建议使用现行版药典收录的方法术语进行描述，对这些不规范却大家又耳熟能详的“前术语”继续使用是否合适，值得商榷。

3 小结

微生物计数法方法适用性中主要问题存在于稀释液的使用、试验菌液的使用、试验菌株的回收试验、抑菌活性的去除、对照试验的开展等方面；控制菌检查法方法适用性中主要问题存在于加菌方式以及耐胆盐革兰阴性菌检查等方面。相关从业人员在开展方法适用性试验时应读懂学透《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1105、1106、1107的具体要求，结合所在实验室实际情况，制定准确可行的操作规程，从“人、机、料、法、环、测”等6个方面达到有效控制各试验环节，切实掌握科学完整准确的试验方法，避免出现文中所述各类常见问题。

从资料审核中可以发现，大部分企业的方法适用性资料比较完整规范，有缺陷的资料占比较小。结合文中发现的问题，各药品生产企业应不断完善和提高开展方法适用性试验的能力，保证试验结果的准确性和可靠性，为人民群众用药安全有效提供保障。