槐枝药材及饮片的质量标准研究

李 敏 刘 洋 郑 鹏 于姗姗 王 亮 张秋红*

槐枝，又名槐嫩蘖，最早收载于《名医别录》，为豆科槐属植物槐Sophora japonicaL.的嫩枝[1]。其具有散瘀止血，清热燥湿等功效，用于崩漏、心痛、赤白带下、痔疮等[2]。槐枝原产中国，现南北各省区广泛栽培，华北和黄土高原地区尤为多见[3]。现代药理学研究表明，槐枝主要具有抗菌、抗炎作用[4-6]，化学成分主要为黄酮类化合物，以芦丁和槲皮素为主[7-10]，近期研究从槐枝中分离得到了高丽槐素[11]，槐枝挥发油的主要成分为棕榈酸、亚油酸和油酸等[12]。

历版《中华人民共和国药典》及山东省地方标准中均未收载槐枝药材及饮片，仅在部分省级标准中收载，且检验项目较单一，为了制定山东省中药材地方标准，笔者收集了栽培于山东省境内的槐枝药材及饮片样品各10批，制订了性状、鉴别、检查、浸出物和有效成分芦丁含量的测定方法，以槐枝药材及饮片的质量评价提供数据支持。

1 材料

1.1 仪器

FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；KQ-600GDV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MS204TS型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器公司）；BX53显微镜（OLYMPUS）；干燥箱（BINDER）；水浴锅；薄层成像系统（CAMAG TLC VISUALIZER）；LC-20A型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）（岛津企业管理有限公司）。

1.2 试剂

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，100080-202012，91.6%），甲醇、冰醋酸、磷酸为色谱纯，实验用水为哇哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材及饮片

槐枝药材及饮片样品各10批，均采集自山东省内，经济南市食品药品检验检测中心张秋红主任药师鉴定为豆科植物槐Sophora japonicaL.的嫩枝。样品信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 性状

2.1.1 槐枝药材性状 本品呈长圆柱形，直径0.3～1.5 cm，外表皮暗绿色至棕褐色，可见突起类圆形皮孔及细纵纹，并有黄白色半圆形的叶痕。质坚硬，不易折断。皮部较薄，形成层呈环状，木部黄白色，髓部类白色或浅棕色。气特异，味微苦。槐枝药材的性状见图1。

图1 槐枝药材

2.1.2 槐枝饮片性状 呈类圆形厚片或圆柱形小段，直径0.3～1.5 cm。外表暗绿色至灰棕色，可见突起类圆形皮孔及细纵纹。质坚硬，切断面浅黄色或黄白色，皮部较薄，形成层呈环状，木部黄白色，髓部类白色或浅棕色。气特异，味微苦。槐枝饮片的性状见图2。

图2 槐枝饮片

2.2 鉴别

2.2.1 显微鉴别 粉末黄绿色。纤维较多，成束或单个散离，淡黄色或浅黄色，细长，平直或稍弯曲，胞腔明显。纤维束周围的薄壁细胞中含草酸钙方晶，形成晶纤维。薄壁细胞呈长条形、类长方形或类方形，直径11～43 μm。草酸钙方晶多见，长方形或不规则形，直径7～14 μm。石细胞散在或成群，淡黄色，呈类多角形、类方形或类长圆形，直径17～41 μm，壁厚薄不匀，胞腔较小。非腺毛长275～480 μm，胞腔内含黄棕色物。具缘纹孔导管直径8～23 μm。主要的显微特征见图3。

图3 槐枝粉末显微特征

2.2.2 薄层色谱法鉴别 取槐枝样品粉末2 g，加石油醚（30～60 ℃）30 ml，超声20 min，滤过，留取滤渣，滤渣挥干后加甲醇50 ml，超声30 min，取滤 液蒸干，残渣加甲醇2 ml，即得。取芦丁对照品，加甲醇制成2 mg/ml的溶液，即得。照薄层色谱法试验[13-14]，吸取上述两种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸∶水（8∶1∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。薄层色谱结果显示，槐枝药材及槐枝饮片均含有芦丁，但槐枝药材的斑点不如槐枝饮片的斑点显色清晰。见图4。

图4 槐枝药材及饮片的薄层色谱

2.3 检查

参照《中华人民共和国药典》2020年版[13]水分测定法（通则0832，第二法）、灰分测定法（通则2302）对槐枝药材及饮片进行测定。见表2。

李立国与鲍学全的交集，出现在2006年左右。李立国早年在辽宁工作，后赴西藏，历任自治区党委常委、副书记，2003年，进京任民政部副部长。2006年，李立国分管彩票工作时，鲍学全正是福彩中心主任。

表2 槐枝药材及饮片的测定结果(%)

10批槐枝药材的水分为5.5%～8.9%，平均值为7.1%；总灰分为3.3%～7.5%，平均值为4.3%。10批槐枝饮片的水分为9.1%～9.5%，平均值为9.3%；总灰分为4.0%～4.7%，平均值为4.4%。

参照《中华人民共和国药典》2020年版[13]灰分测定法（通则2302），测定了10批槐枝药材的酸不溶性灰分，结果为0.07%～0.14%，根据测定结果，暂不增加此检查项目。

2.4 浸出物

取7号样品，分别以水、30%乙醇溶液、70%乙醇溶液及乙醇作为提取溶液，考察冷浸法及热浸法的浸出物差异，以对提取方式和提取溶液进行优选。水溶液热浸法的浸出物含量最高，且经济环保，因此，采用水溶性浸出物测定法项下的热浸法测定。

参照《中华人民共和国药典》2020年版[13]浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法，测定水溶性浸出物，测定结果见表2。10批槐枝药材浸出物结果在9.8%～19.6%，平均值为12.3%；10批槐枝饮片浸出物结果在18.5%～19.6%，平均值为19.1%。

2.5 含量测定

2.5.1 样品溶液制备 取槐枝粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 ml，密塞，称定重量，超声处理（500 W，频率40 kHz）30 min，取出，冷却至室温，用50%甲醇溶液补足减失的量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.5.2 标准溶液制备 精密称取芦丁对照品适量，加甲醇配制成含芦丁0.050 7 mg/ml的溶液，作为对照品储备溶液。精密吸取对照品储备溶液4 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液（C对为0.020 3 mg/ml）。

2.5.3 色谱条件 Kromasil 100-5-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈∶甲醇∶0.5%磷酸（13∶13∶74）；检测波长257 nm；柱温35 ℃。理论板数按芦丁峰计算应不低于3 000。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 系统适应性试验 按照2.5.3项下的色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl注入液相色谱仪，结果表明对照品与供试品溶液在相应的保留时间有相应的峰形，理论塔板数按芦丁峰计不低于3 000，系统适应性符合要求。对照品和槐枝样品高效液相色谱法（HPLC）图谱见图5。

图5 对照品溶液、槐枝样品溶液色谱

2.5.4.2 线性关系考察 精密吸取对照品储备液1、2、4、8、10、15 μl进样，按2.5.3项下的色谱条件测定，以色谱峰面积为纵坐标，以芦丁对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得芦丁对照品的线性方程：y=2 058.3x-52.334，相关系数为r=0.999 8，线性范围为50.7～760.6 ng。

2.5.4.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液（C对= 0.020 3 mg/ml），连续进样6次，每次10 μl，芦丁峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.4%。

2.5.4.4 重复性试验 取19号样品，按2.5.1项下的的方法制备供试品溶液，平行操作6次，按2.5.3项下的色谱条件测定，芦丁的平均含量为0.39%，RSD为1.5%。

2.5.4.5 稳定性试验 取19号样品，按2.5.1项下的的方法制备供试品溶液，分别在0、1、4、8、12、24 h进样10 μl，芦丁峰面积的RSD为0.2%。

2.5.4.6 准确度试验 取19号样品（水分为9.1%，芦丁含量为0.39%）6份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品储备液（C对= 0.050 7 mg/ml）20 ml，再精密加入甲醇5 ml、水25 ml，按2.5.1项下的方法制备供试品溶液，按2.5.3项下的色谱条件测定。芦丁的平均回收率为103.6%，RSD为1.7%。

2.5.5 样品测定 取收集到的10批槐枝药材和10批槐枝饮片样品，按照2.5.1项下的方法制备供试品溶液，按照2.5.3项下的色谱条件，测定槐枝药材和饮片中芦丁的含量。见表3。

表3 槐枝样品含量测定结果(%,n=2)

试验结果表明，10批槐枝药材中芦丁的含量在0.12%～0.25%，平均含量为0.17%；10批槐枝饮片中芦丁的含量在0.20%～0.39%，平均含量为0.26%。根据测定结果，暂定含量限度为按干燥品计，含芦丁（C27H30O16）不得少于0.50%。

3 讨论

3.1 定性及定量成分的选择

现代药理学研究表明，槐枝含有较多的黄酮类化合物，芦丁为其主要化学成分，具有消炎、增强免疫力等药理活性[4-10]，因此，选其作为槐枝药材及饮片的鉴别和含量指标。

3.2 薄层色谱方法考察及结果分析

在薄层色谱鉴别研究[14]中，参照2020年版《中华人民共和国药典》槐米的薄层鉴别方法，考察了脱色剂[乙醚、石油醚（30～60 ℃）、石油醚（60～90 ℃）]，提取方式（超声、回流提取），薄层板厂家（青岛海洋、德国Merk、烟台银龙），点样量（2、5、10 μl），展开剂（乙酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水）对薄层色谱的影响，最终确定了薄层色谱鉴别方法。

本研究薄层色谱结果显示，槐枝药材及槐枝饮片均含有芦丁，但槐枝药材的斑点不如槐枝饮片的斑点显色清晰，提示槐枝药材的芦丁含量可能低于槐枝饮片的芦丁含量。

3.3 检查项及浸出物结果分析

根据测定结果，建议槐枝药材及饮片的水分限度为不超过12.0%，总灰分限度为不超过10.0%，水溶性浸出物限度为不得少于8.0%。暂不增加酸不溶性灰分检查。

3.4 HPLC方法考察及结果分析

在HPLC测定的提取过程中，分别考察了提取溶剂（甲醇、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液）、提取方法（静置过夜、超声提取、加热回流提取）、提取时间（30 min、40 min、60 min），选定50%甲醇溶液，超声处理30 min为样品制备条件。然后，采用二极管阵列检测器在200～400 nm波长下进行扫描，采集光谱图，通过观察光谱图发现，芦丁在257 nm和355 nm波长处均有最大吸收，但在257 nm下采集的色谱图，芦丁的基线更平稳，色谱峰的分离度更好，因此选择芦丁的测定波长为257 nm。又分别考察了流动相[甲醇-1%冰醋酸溶液（32∶68）、乙腈-2.5%冰醋酸溶液（13∶87）、甲醇-0.01 mol/L乙酸铵溶液（47∶53）、乙腈∶甲醇∶0.5%磷酸溶液（13∶13∶74）]、色谱柱（Kromasil 100-5-C18、Agilent Zorbax SB C18、VP-ODS C18）、流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）、柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃），选定乙腈∶甲醇∶0.5%磷酸溶液（13∶13∶74）为流动相，流速1.0 ml/min，柱温35 ℃作为HPLC检测条件。

槐枝药材的芦丁含量普遍低于槐枝饮片的芦丁含量，印证了薄层色谱鉴别的猜测。说明炮制过程提高了槐枝中芦丁的提取含量，参考槐米的炮制过程[15]，合适的炮制温度会提高槐米中总黄酮类成分的含量。因此，选择合适的炮制温度及时间，可以提高槐枝饮片中有效成分芦丁的含量。

本文对槐枝药材及饮片进行了性状、显微鉴别及薄层色谱鉴别、水分及总灰分检查、水溶性浸出物检查并进行了槐枝中芦丁HPLC定量测定方法的考察，初步完成了槐枝药材及饮片质量标准研究，但在农药残留及有害元素等方面的控制与安全评价还有待于进一步研究，不断完善其质量方案。