不同醋酸菌及发酵方式对柑橘果醋品质的影响

刘天宇，丁健洋，许立伟，薛桂新

（延边大学 农学院，吉林 延吉 133000）

柑橘（Citrus reticulataBlanco）是我国南方栽培的重要果树之一[1]，面积和产量较大[2]。柑橘采收后货架期短，收获旺季导致滞销、腐烂等问题，造成资源浪费和经济损失。柑橘酸甜适中，汁水丰富，适合加工果醋等制品。果醋是集营养、保健和食疗等功能为一体的新型调味品[3-4]，将柑橘加工成果醋可为其加工利用提供一条新途径。

目前柑橘果醋的研究报道较多，主要集中在对柑橘果醋发酵条件、发酵基质、发酵方式、风味成分及微生物多样性等方面。孙娜[5]采用三种发酵方式对柑橘醋发酵品质及微生物多样性进行了研究，结果固态发酵菌群较液态发酵丰富；杨馨悦等[6]优化了柑橘果醋液态表面和液态深层发酵工艺；杨宇驰等[7]比较研究了一次和二次发酵对柑橘果醋品质的影响，结果一次发酵周期比二次发酵长；王炳宇等[8]研究了不同发酵基质柑橘果醋挥发性成分的差异。CHEN Y等[9]对混菌发酵柑橘果醋进行了研究；HU F F等[10]对柑橘果醋沉淀的化学成分、形成机理及抗增殖作用进行了研究。但有关不同醋酸菌及发酵方式对柑橘果醋品质的影响尚少见报道。

本研究以柑橘为原料，采用沪酿1.01、AS1.41和许氏醋酸菌三种醋酸菌，通过一次发酵、二次发酵两种发酵方式分别制备6种柑橘果醋，并通过分析这6种果醋理化指标，比较其品质差异，旨在探讨不同醋酸菌及发酵方式对柑橘果醋品质的影响，为柑橘果醋产业化技术研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司；沪酿1.01醋酸菌：上海酿造科学研究所；AS1.41醋酸菌：中国普通微生物菌种保藏管理中心；许氏醋酸菌（Acetobacter schutzenbachii）：浙江临海市利民化工有限公司；果胶酶（酶活50 000 U/g）：德国三颗星食品公司；食用酒精（酒精度85%vol）：牡丹江白酒厂；柑橘果酒（酒精度6%vol）、柑橘果汁（可溶性固形物为10.8°Bx）：实验室自制。

甲醇、乙腈、冰醋酸、磷酸（均为色谱纯）：北京迈瑞达有限公司；草酸、DL-酒石酸、L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸、琥珀酸、没食子酸、（+）-儿茶素、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、白藜芦醇、表儿茶素、阿魏酸、芦丁、槲皮素标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；其他化学试剂（分析纯及生化试剂）：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA224S分析天平：塞多利斯（中国）科技有限公司；SX-700高压蒸汽灭菌器：日本TOMY公司；TDZ5-WS高速离心机：湖南湘仪实验仪器有限公司；CM-5色差仪：北京柯尼卡美能达投资有限公司；LC-2010A高效液相色谱仪、L-8900氨基酸分析仪：日本岛津公司；Promosil C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：博纳艾杰尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌液体培养基

沪酿1.01醋酸菌液体培养基：1%葡萄糖和1%酵母浸膏用蒸馏水溶解，121 ℃灭菌20 min，使用前加入4%食用酒精。

AS1.41醋酸菌液体培养基：10%葡萄糖和1%酵母浸膏用蒸馏水溶解，121 ℃灭菌20 min，使用前加入4%食用酒精。

许氏醋酸菌液体培养基[11]：1%葡萄糖和1%酵母膏，121 ℃灭菌20 min，使用前按体积分数3%加入无水乙醇。

1.3.2 柑橘果醋实验设计

本实验采用种醋酸菌及两种发酵方式制备六种柑橘果醋，其代号及发酵液组成见表1。

表1 六种柑橘果醋实验设计Table 1 Experimental design of six kinds of citrus fruit vinegar

1.3.3 柑橘果醋加工工艺流程及操作要点

（1）一次发酵法

（2）二次发酵法

（3）二次发酵法操作要点

柑橘去皮、榨汁、柑橘去皮榨汁后用120目的滤布过滤。

酶解：滤汁按照10 kg柑橘添加1 g果胶酶进行常温酶解4 h。

调糖：酶解结束后添加白砂糖，调整糖度为20°Bx。

酵母菌活化：取活性干酵母加入10倍35～38 ℃无菌蒸馏水搅拌溶解，在此温度水浴活化20～30 min。

酒精发酵：在柑橘果汁中加入0.02%活化后的酵母，置20～24 ℃室温条件下发酵至酒精度为12%vol左右。

醋酸菌活化：将醋酸菌接入液体培养基，在30 ℃恒温培养至醋酸菌菌落数＞108CFU/m L。

醋酸发酵：柑橘果酒用蒸馏水稀释至酒精度为6%vol，按10%（V/V）接种量接种醋酸菌，于32 ℃条件下发酵，每隔12 h取样测定醋酸含量，醋酸含量不再增加时结束发酵。

果醋杀菌：70 ℃条件下杀菌30 min。

陈酿：常温下陈酿贮存3个月。

（4）一次发酵法操作要点

柑橘果汁90 ℃恒温杀菌30 min，待温度冷却至室温，将原果汁用蒸馏水稀释至50%后加入食用酒精至酒精度为6%vol，按10%（V/V）接种量接种醋酸菌。其他操作要点同二次发酵法。

1.3.4 柑橘果汁和果醋品质指标测定

总酸、蛋白质测定：分别采用GB 12456—2021《食品中总酸的测定》和GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》；总糖测定：采用苯酚-硫酸法[12]；总多酚测定：采用Folin-Ciocalteu法[13]；总黄酮测定：采用闫慧君等[14]的方法；单体酚测定：采用孙翔宇等[15]的高效液相色谱法，其色谱条件如下：Promosil C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，进样量20 μL；采用梯度洗脱，流动相A：乙腈-冰乙酸（98∶2，V/V），流动相B：水-冰乙酸（98∶2，V/V）。有机酸含量测定：采用GB 5009.157—2016《食品中有机酸的测定》；氨基酸测定：参考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》。柑橘果醋颜色参数L*值（明亮度）、a*值（红色度）、b*值（黄色度）测定：采用汤晓宏等[16]的方法；透光率测定：采用程浩[17]的方法。

1.3.5 数据分析

实验数据通过Excel2016和SPSS22.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同醋酸菌和发酵方式对柑橘果醋总酸的影响

不同醋酸菌和发酵方式对柑橘果醋总酸含量的影响结果见图1。由图1可知，在酒精含量为6%vol的条件下，不同醋酸菌对总酸含量影响无显著差异（P＞0.05），但发酵快慢不同，沪酿1.01醋酸菌发酵最快，许氏醋酸菌最慢，AS1.41醋酸菌居中，这与3种醋酸菌发酵特性有关，沪酿1.01醋酸菌将乙醇发酵为乙酸的能力最强，许氏醋酸菌最弱，AS 1.41醋酸菌介于二者之间。3种醋酸菌二次发酵比一次发酵得快，这与发酵底物有关，醋酸菌将乙醇氧化为乙酸的能力很强，而将葡萄糖氧化为葡萄糖酸的能力很弱，一次发酵底物中有果汁，其葡萄糖含量高于二次发酵，氧化代谢糖需要时间长一些，所以发酵得慢。这说明发酵菌种及发酵方式对醋酸发酵快慢均有一定的影响。

图1 不同醋酸菌及发酵方式对6种柑橘果醋发酵过程中总酸含量的影响Fig.1 Effects of different acetic acid bacteria and fermentation methods on total acid contents in six kinds of citrus vinegar samples

2.2 不同醋酸菌和发酵方式对柑橘果醋总糖、总多酚、总黄酮、蛋白质及单体酚含量的影响

不同醋酸菌和发酵方式对柑橘果醋总糖、总多酚、总黄酮及蛋白质含量的影响结果见表2。

表2 不同柑橘醋酸菌及发酵方式对6种果醋总糖、总酚、总黄酮及蛋白质含量的影响Table 2 Effects of different acetic acid bacteria and fermentation methods on total sugar,total phenols,total flavones and protein contents in six kinds of citrus vinegar samples

由表2可知，同种发酵方式3种菌种相比，总多酚、总黄酮、蛋白质含量呈现出相同的规律，AS1.41醋酸菌＞沪酿1.01醋酸菌＞许氏醋酸菌，且存在显著性差异（P＜0.05）。总糖含量均为许氏醋酸菌＞AS1.41醋酸菌＞沪酿1.01醋酸菌。同种醋酸菌两种发酵方式相比，总糖、总多酚、总黄酮、蛋白质含量一次发酵法均显著高于二次发酵法（P＜0.05）。

10种单体酚标准品标准曲线回归方程及相关系数见表3。由表3可知，10种单体酚标准品在质量浓度10～300 mg/L范围内线性关系良好，相关系数R2均＞0.999。

表3 10种单体酚标准品标准曲线回归方程及相关系数Table 3 Regression equation and correlation coefficient of standard curves of ten free phenols standards

6种柑橘果醋中单体酚含量测定结果见表4。由表4可知，6种柑橘果醋均检测出10种单体酚，单体酚含量与总多酚、总黄酮、蛋白质含量顺序一致，同种发酵方式3种醋酸菌相比，单体酚总含量高低依次为AS1.41醋酸菌＞沪酿1.01醋酸菌＞许氏醋酸菌，且存在显著性差异（P＜0.05）。同种醋酸菌两种发酵方法相比，单体酚含量一次发酵法显著高于二次发酵法。分析原因主要与发酵底物有关，一次发酵底物是酒精度为6%vol食用酒精的果汁，二次发酵底物是用蒸馏水稀释酒精度为6%vol酒精的发酵酒，果汁中总糖、总多酚、总黄酮、蛋白质含量高于稀释酒，另外二次发酵的果醋多酚和黄酮等发生氧化水解，多酚含量降低[18]，所以一次发酵醋高于二次发酵醋。

表4 6种柑橘果醋中单体酚含量测定结果Table 4 Determination results of ten free phenols in six kinds of citrus vinegar mg/L

同种发酵方式3种醋酸菌相比，AS1.41醋酸菌＞沪酿1.01醋酸菌＞许氏醋酸菌，可能与3种醋酸菌对这些成分代谢能力不同有关。AS1.41醋酸菌对单体酚、总多酚、总黄酮、蛋白质代谢能力低于沪酿1.01醋酸菌和许氏醋酸菌，而对糖的代谢能力高于沪酿1.01但低于许氏醋酸菌。

10种单体酚主要分为酚酸类化合物和类黄酮物质，没食子酸，绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸属于酚酸类化合物[19]，儿茶素、表儿茶素、芦丁和槲皮素等属于类黄酮[20]。采用AS1.41醋酸菌一次发酵的果醋中咖啡酸、绿原酸、对香豆酸和芦丁含量高于其他5种果醋，儿茶素和槲皮素含量也较高，这与AS1.41醋酸菌发酵特性及一次发酵底物中含有原果汁有关。

2.3 不同醋酸菌和发酵方式对柑橘果醋有机酸的影响

6种有机酸标准品标准曲线回归方程及相关系数见表5。由表5可知，6种有机酸质量浓度和检测峰面积相关性较好，标准曲线回归方程相关系数R2均≥0.999 4。

表5 6种有机酸标准品标准曲线回归方程及相关系数Table 5 Regression equation and correlation coefficient of standard curves of six organic acid standards

6种柑橘果醋中有机酸含量测定结果见表6。由表6可知，6种柑橘果醋均含有6种有机酸，且有机酸总含量高低依次为PCV101＞PCV141＞SCV141＞PCVAS＞SCV101＞SCVAS，其中一次发酵法有机酸总含量高低依次为PCV101＞PCV141＞PCVAS，二次发酵法有机酸总含量高低依次为SCV141＞SCV101＞SCVAS，说明沪酿1.01和AS1.41菌种有机酸总含量均高于许氏醋酸菌，一次发酵法有机酸总含量高于二次发酵法，这与发酵底物以及3种醋酸菌发酵特性不同有关。

表6 6种柑橘果醋中有机酸含量测定结果Table 6 Determination results of organic acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/L

从单一有机酸含量来看，6种柑橘果醋均是柠檬酸＞酒石酸＞琥珀酸＞苹果酸＞乳酸＞草酸（AS1.41菌种二次发酵苹果酸与乳酸例外），且均具有显著性差异（P＜0.05）。柠檬酸是柑橘中含量最高的酸，果醋中柠檬酸含量高在一定程度上缓解乙酸刺激性气味，使柑橘果醋味道变得柔和丰满[21-22]。

2.4 不同醋酸菌和发酵方式对柑橘果醋氨基酸含量的影响

6种柑橘果醋中氨基酸含量测定结果见表7。由表7可知，6种果醋分别检测出17种氨基酸，其中7种为必需氨基酸，这说明柑橘果醋中氨基酸含量比较丰富，主要来源包括原果汁中含有氨基酸、发酵过程中果实中蛋白质降解为氨基酸以及醋酸菌代谢释放出的氨基酸[23]。6种柑橘果醋的总氨基酸（total amino acid，TAA）和非必需氨基酸（non-essential amino acid，NAA）含量高低依次为PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCV101＞SCVAS；而EAA含量高低依次为PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCVAS＞SCV101，即采用1.41醋酸菌一次发酵的6种果醋TAA、必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、NAA含量均为最高，分别为1 830.10 mg/kg、420.80 mg/kg和1 409.30 mg/kg；一次发酵法TAA、EAA、NAA含量均显著高于二次发酵法（P＜0.05），可能是由于二次发酵过程中游离氨基酸通过Strecker降解的缘故[24]。

表7 6种柑橘果醋中氨基酸含量测定结果Table 7 Determination results of amino acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/kg

氨基酸的种类与含量不同，对果醋的风味品质也有一定的影响。6种柑橘果醋呈味氨基酸含量测定结果见表8。由表8可知，鲜味氨基酸主要包括天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸；甜味氨基酸主要包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、组氨酸和脯氨酸；苦味氨基酸主要包括缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸；芳香族氨基酸主要有酪氨酸和苯丙氨酸[25]。鲜、甜、苦、香4种呈味氨基酸含量及其总含量高低均为PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCV101＞SCVAS，且具有显著性差异，均是AS1.41＞沪酿1.01＞许氏醋酸菌。4种呈味氨基酸含量高低相比，均是甜味氨基酸＞鲜氨基酸＞苦氨基酸＞芳香族氨基酸。

表8 6种柑橘果醋呈味氨基酸含量测定结果Table 8 Determination results of flavor amino acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/kg

2.5 不同醋酸菌和发酵方式对柑橘果醋色泽和透光率的影响

由表9可知，6种柑橘果醋除了个别果醋，明亮度和澄清度均为二次发酵法显著高于一次发酵法（P＜0.05），黄色度一次发酵法高于二次发酵法，由于柑橘醋是黄色的所以红色度均很低。不同醋酸菌对果醋L*值、a*值、b*值和澄清度的影响显著（P＜0.05）。

表9 6种柑橘果醋颜色参数及透光率的比较Table 9 Comparison of color parameters and light transmittance of six kinds of citrus vinegar

3 结论

本研究以柑橘为原料，采用3种醋酸菌（沪酿1.01、AS1.41、许氏醋酸菌）两种液态发酵方式（一次发酵法、二次发酵法）共发酵6种柑橘果醋。对6种柑橘果醋总酸、总糖、总多酚、总黄酮、有机酸、单体酚、氨基酸含量及果醋颜色、澄清度等理化指标进行了综合分析。结果表明，采用AS1.41醋酸菌和一次发酵法加工的果醋总多酚、总黄酮、蛋白质、单体酚、总氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、呈味氨基酸含量均高于其他5种果醋，沪酿1.01和AS1.41醋酸菌一次发酵法和二次发酵法有机酸总含量均高于许氏醋酸菌。因此，AS1.41醋酸菌和一次发酵法加工的柑橘果醋最好。