附睾血管内皮生长因子基因慢病毒干扰载体的构建

戴研平 王 平 高晓勤

（1 岳阳职业技术学院医学院，岳阳 414000；2 遵义医药高等专科学校基础医学院，遵义 563006）

抗肿瘤血管生成基因治疗是目前肿瘤治疗的热点之一[1-2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞生长和分化的首要因子，在血管生成过程中起关键作用。以VEGF/VEGFR2为靶点的肿瘤血管生成抑制剂研究较为广泛，由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）具有高效性、特异性、稳定性和安全性等优点，目前利用高效基因抑制工具-RNA干扰技术阻断VEGF/VEGFR2信号转导通路成为当今抗肿瘤基因治疗的研究重点[3]。这些药物在恶性肿瘤治疗中能有效地延长患者的无进展生存率以及总生存期，并已被批准用于多种实体肿瘤如结直肠癌、肺癌（非小细胞肺癌）、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌和肾癌等的治疗[4-12]，但其在男性生殖系统的相关研究较少。本研究构建VEGF的慢病毒shRNA表达载体转染大鼠附睾，研究转染后VEGF的表达。通过实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）和蛋白免疫印迹实验筛选能明显降低附睾VEGF表达水平的RNA干扰载体，为进一步研究由慢性砷中毒引起男性不育的分子机制提供新的靶点和实验依据。

1 材料和方法

1.1 试剂

PM7.1（上海生物过程股份有限公司）；Taq酶和dNTP（TaKaRa公司）；T4 DNA ligase（Fermentas 公司）；Annealing Buffer for DNA Oligos（5X） （碧云天（D0251） 公司）；AgeI-HF（NEB（R3552L）公司）；EcoRI-HF（NEB（ R3101L） 公司）；DH5a感受态细胞 、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DL 2 000 DNA Marker（TaKaRa公司）；小抽试剂盒（Promega公 司）；DNA ladder marker （Fermentas 公司）；引物合成和阳性克隆质粒测序（上海生物工程股份有限公司）；293T 人胚肾细胞（本课题组保存）；青霉素-链霉素、胰酶、无钙镁的磷酸盐缓冲液（GIBCO公司）。

1.2 VEGF-shRNA靶点设计及慢病毒载体构建

根据基因库报道的大鼠附睾特异VEGF基因序列（NCBI登录号：NM_031836.3）和RNAi靶点序列设计原则，筛选出3个VEGF的干扰靶点，同时设计一个阴性对照。引物均由上海生物工程有限公司合作完成。DNA合成片段如下：shRNA-1GCAGCTATTGCCGTCCAATTGCTCGAGCAATTGGAC GGCAATAGCTGCTTTTTTG；shRNA-2 CCGGGC GGATCAAACCTCACCAAAGCTCGAGCTTTGGT GAGGTTTGATCCGCTTTTTTG；shRNA-3 CCGG GCCAGCACATAGGAGAGATGACTCGAGTCATC TCTCCTATGTGCTGGCTTTTTTG。

引物退火形成带粘性末端的双链后将干扰片段连接入表达载体，于16 ℃连接过夜。转化后进行阳性克隆的鉴定，PCR反应条件如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，10 ℃ 10 min，30个循环。PCR阳性克隆测序由上海生物工程有限公司合作完成，并进行测序结果分析。

1.3 慢病毒载体的包装、浓缩和滴度测定

根据天根质粒小提试剂盒的操作方法进行质粒的抽提及慢病毒的包装、浓缩和滴度测定。采用超速离心沉淀法进行慢病毒的浓缩与纯化；采用定量PCR法进行病毒滴度的测定，通过计算得出重组慢病毒的滴度为6.72×108、8.10×108、8.62×108TU/L。

1.4 慢病毒载体感染大鼠附睾组织

将健康清洁级雄性SD大鼠用水合氯醛麻醉后分为空白对照组、NC-shRNA阴性感染组、VEGFshRNA-1感染组、VEGF-shRNA-2感染组、VEGFshRNA-3感染组。常规消毒铺手术巾单，暴露双侧大鼠附睾处皮肤，仔细解剖暴露附睾，将200 μL病毒液（本实验干扰慢病毒未携带荧光标记）分别注射到各组大鼠双侧附睾。每组随机选取大鼠3只进行处理，手术完毕后每只大鼠肌肉注射青霉素8万单位抗炎，并在无菌动物房饲养14 d。14 d后麻醉大鼠，无菌剥离双侧附睾组织进行后续相关实验。

1.5 RT-qPCR检测各组睾丸组织VEGF mRNA的表达

TRIzol法 提 取RNA后逆转录成cDNA。内参基因β-actin正向引物序列为5'-AGCGAGCA- TCCCCCAAAGTT-3'，反向引物序列为5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'；VEGF正向引物序列为5'-GAGCAACGTCACTATGCAGATC-3'；反 向引物序列为5'-TTTCTCCGCTCTGAACAAGG-3'。PCR反应条件如下：25 ℃ 孵育10 min；cDNA合成 50 ℃ 30 min；终止反应85 ℃ 5 min，置于冰上。将上述溶液-20 ℃保存。将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。反应体系总体积20 µL，采用2-ΔΔCt公式计算相对表达量。

1.6 免疫印迹检测各组VEGF蛋白的表达

取附睾组织碾磨成粉末状，使用RIPA裂解液裂解组织，抽提总蛋白。采用BCA试剂盒定量蛋白后常规行蛋白质免疫印迹法检测VEGF表达水平。VEGF兔抗鼠多克隆工作浓度为1∶1 000，二抗工作浓度为1∶5 000，ECL发光、曝光、显影2 min，定影。应用Bio-Rad公司的全自动凝胶成像系统扫描蛋白条带，以目的条带与内参（β-actin）条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

1.7 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示。两组间比较采用LSD-t检验，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）和方差齐性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒质粒转染结果

慢病毒包装后感染 293 T 细胞，荧光显微镜观察可见荧光表达，且表达情况良好（图1）。

图1 各组大鼠慢病毒质粒转染图片

2.2 VEGF-shRNA重组质粒的DNA测序结果

将PCR阳性克隆质粒进行DNA测序，结果与预期序列一致，表明合成的VEGF-shRNA寡聚核苷酸序列插入正确，证明DNA重组成功。

2.3 慢病毒干扰大鼠附睾VEGF对VEGF mRNA表达的影响

各组重组慢病毒颗粒感染大鼠附睾组织后，与空白对照组比较，NC-shRNA阴性感染组的VEGF mRNA表达水平差异无 统 计 学 意义（P＞0.05），VEGF-shRNA-1、2、3感 染 组VEGF mRNA表 达水平均低于对照组及NC-shRNA阴性感染组（P＜ 0.05），其中以VEGF-shRNA-3感染组下降最显著（P＜0.05）（图2）。

图 3 VEGF-shRNA感染大鼠附睾组织对VEGF mRNA表达的影响

2.4 慢病毒干扰大鼠附睾VEGF对VEGF蛋白表达的影响

各组重组慢病毒颗粒感染大鼠附睾组织后，与空白对照组相比，NC-shRNA阴性感染组的VEGF蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），VEGFshRNA-1、2、3感染组VEGF的蛋白表达水平均低于正常对照组及NC-shRNA阴性感染组，其中以VEGF-shRNA-3组下降最显著（P＜0.05）（图4）。

图 4 VEGF-shRNA感染大鼠附睾组织对VEGF蛋白表达的影响

3 讨论

目前最常用的RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的手段主要有以下几种： RNA干扰片段的直接转染、通过介导质粒、慢病毒作为载体的RNAi。基因沉默即小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）通过碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，与siRNA和Dicer形成的复合体结合，经过换位、Dicer的切割，导致由特定目的基因转录产生的mRNA功能沉默，并产生级联放大效应[11-13]。RNAi通过dsRNA启动，经过同源mRNA的降解，特异性地阻断目的基因的表达，实现基因沉默，由于其具有干扰范围广、高效的优点，已经被作为一种基因功能研究的有效工具并广泛应用于肿瘤治疗方面[14]。

众所周知，附睾功能的异常会影响精子的成熟，导致男性不育。而VEGF和VEGFR2参与了精子的发生和成熟[15-16]。本课题组前期研究结果发现慢性砷中毒不同剂量组大鼠VEGF及其受体2的mRNA及蛋白表达具有差异[17]。为明确VEGF对慢性砷中毒大鼠雄性生殖能力影响的具体机制，本研究利用RNAi构建大鼠附睾VEGF的慢病毒shRNA表达载体并进行包装，将通过验证的高滴度病毒感染大鼠附睾组织后观察其沉默效果。PCR阳性克隆质粒DNA测序结果与预期序列一致，证明DNA重组成功，即成功构建了VEGF-shRNA重组表达质粒。RT-qPCR及免疫印迹检测结果显示，与空白对照组比较，NC-shRNA阴性感染组的VEGF的mRNA及蛋白表达水平无明显差异，VEGF-shRNA-1、2、3感染组VEGF的mRNA及蛋白表达水平均低于对照组及NC-shRNA阴性感染组，其中以VEGFshRNA-3 组干扰效果最明显，对VEGF的表达有很好的抑制作用，笔者将筛选出沉默效果最佳的表达质粒VEGF-shRNA-3进行后续的相关研究。

总之，本研究成功建立了3种VEGF基因的RNA干扰靶点的慢病毒载体，通过阳性克隆质粒测序和免疫印迹方法证实，VEGF基因的沉默效果明显，为下一步研究VEGF基因为靶点的RNAi技术治疗男性不育奠定了实验基础。