RAD51相关蛋白1在宫颈癌组织中的表达及通过TGF-β/Smad 通路 参与调控人宫颈癌细胞的增殖和凋亡*

梁殿迅 王秋宇 姜 平 李和丽 朱军义 许 静 郭 哲 孙慧霞

（南阳市中心医院，南阳 473000）

宫颈癌是妇女常见恶性肿瘤，晚期患者生存率仍然很低，因此，寻找新的治疗靶点对宫颈癌的治疗具有重要意义[1-2]。RAD51相关蛋白1（RAD51-associated protein 1，RAD51AP1）是一种能激活同源重组蛋白RAD51的DNA结合蛋白，可调控肿瘤细胞增殖与DNA修复[3]。研究显示[4]，RAD51AP1在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中上调表达，沉默RAD51AP1可抑制NSCLC的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和转移。转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）/SMAD通路在宫颈癌的发生发展中起着重要调控作用，TGF-β/Smad 通路的激活可促进宫颈癌细胞的增殖与迁移[5]。本研究探讨RAD51AP1对SiHa细胞增殖及TGF-β/Smad 通路的影响，初步探索RAD51AP1对SiHa细胞的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞与试剂

人正常宫颈上皮细胞（HUCEC）及宫颈癌Caski、Hela、C-33A、SiHa细胞系购自美国ATCC公司；人重组TGF-β1（规格1 mg）购自 HUICH公司；LY2109761（纯度≥99%）购自Aladdin公司；Lipofectamine 3000转染试剂盒、DMEM培养液和胰酶购自美国Invitorgen公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒购自美国Sigma公司；RAD51AP1、TGF-β1及内参GAPDH引物由上海生工生物工程科技有限公司设计与合成；抑制RAD51AP1表达（si-RAD51AP1）及其阴性对照（si-NC）质粒由广州锐博生物有限公司构建；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司；兔抗人RAD51AP1、TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3、cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3抗体购自英国Abcam公司。

1.2 标本来源

选 取2018年7月至2021年3月间河南省南阳市中心医院手术治疗的51例宫颈癌患者为研究对象，年龄37~75岁，平均年龄（49.50±9.20）岁。手术过程中取宫颈癌组织及相应癌旁组织。51例患者中32例为鳞状细胞癌，19例为腺癌。

1.3 免疫组织化学检测宫颈癌组织与癌旁组织RAD51AP1蛋白表达

宫颈癌组织与癌旁组织标本常规石蜡包埋后切片，经过二甲苯脱蜡，0.01 mol/L枸缘酸缓冲液抗原修复和封闭后，加入兔抗人RAD51AP1多克隆抗体（1∶500），室温孵育4 h，再加入相应二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，DAB染色，显微镜观察。染色结果判断：RAD51AP1主要定位于细胞核，根据阳性细胞数和染色强度进行评分。阳性细胞率＜5%、5%~25%、26%~50%、51%~75%、＞75%，分别记为0、1、2、3、4分；根据细胞染色强度，棕褐色为3分，棕黄色为2分，淡黄色为1分，无染色为0分。将两项评分相乘：得分为0或1分为阴性（-），2~3分为弱阳性（+），4~6分为中阳性（++），6分以上为强阳性（+++）。

1.4 免疫印迹检测宫颈癌细胞RAD51AP1蛋白表达及细胞分组

宫颈癌Caski、Hela、C-33A、SiHa细胞与人正常宫颈上皮细胞（HUCEC）接种于6孔板，培养48 h后，提取细胞总蛋白，免疫印迹检测细胞中RAD51AP1蛋白表达，筛选RAD51AP1高表达宫颈癌细胞系。

收集对数生长期细胞，将SiHa细胞分为对照组、si-RAD51AP1组、si-NC组、抑制剂组、si-RAD51AP1+激活剂组，si-RAD51AP1组。si-NC组使用Lipofectamine 3000转染试剂盒分别转染si-RAD51AP1、si-NC质粒，抑制剂组使用10 μmol/L的LY2109761处 理24 h，si-RAD51AP1+激 活 剂组转染si-RAD51AP1质粒同时使用10 ng/mL的人重组TGFβ1处理24 h。TGF-β/Smad通路抑制剂LY2109761与激活剂人重组TGFβ1浓度参照文献[6]中所用浓度。

1.5 MTT法检测细胞增殖活性

各组处理的SiHa细胞以每孔5×104个细胞接种于96孔板中，分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，反应4 h后，DMSO溶液终止反应，于酶标仪波长490 nm处测定各孔光密度（OD）值，绘制细胞生长曲线。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

各组处理的SiHa细胞培养48 h后，调整细胞浓度为4×105/mL，加 入200 μL的binding buffer重悬细胞，分别加入5 µL的Annexin V-FITC与10 µL的PI混匀，避光孵育20 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 平板克隆形成实验检测细胞增殖

取对数生长期的各组SiHa细胞，制备细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、 5% CO2培养箱中培养，每隔2~3 d观察细胞形态，待培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。多聚甲醛溶液固定20 min，结晶紫染色10 min，显微镜观察并拍照，计算克隆形成率。

1.8 实时荧光定量PCR法检测细胞RAD51AP1及TGF-β1 mRNA水平

采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中RAD51AP1、TGF-β1 mRNA相对表达量。TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA。RAD51AP1上游引物序列为5'-ATGACAAGCTCTACCAGAGAGAC-3'，下游引物序列为5'-CACATTAGTGGTGACTGTTGGAA- 3'；TGF-β1上游引物序列为5'-CTGCAAGACTATC GACATGG-3'，下游引物序列为5'-AATGGTGGAA ACCCACAACG-3'；GAPDH上游引物序列为5'-AA TGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物序列为5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法 计 算RAD51AP1、TGF-β1 mRNA相对表达量。

1.9 免疫印迹检测细胞中RAD51AP1蛋白、TGF-β/Smad通路相关蛋白及增殖、凋亡相关蛋白表达

提取各组SiHa细胞总蛋白，取适量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳并转至PVDF膜上，使用含5% BSA的TBST缓冲液封闭1 h，分别加入稀释后的兔抗人RAD51AP1、TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3、cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3和β-actin抗体，4℃孵育过夜加入二抗，4℃孵育6 h，ECL液显色，以β-actin为内参，采用Image J软件分析各蛋白相对表达量。

1.1 0 统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAD51AP1蛋白在宫颈癌组织与癌旁组织的表达

免疫组织化学显色结果显示，RAD51AP1主要定位于宫颈癌组织中的细胞核，癌旁组织阳性率为25.49%，宫颈癌组织中阳性率为72.55%，宫颈癌组织的阳性率显著高于癌旁组织（P＜0.05）（图1，表1）。

图1 RAD51AP1蛋白在癌旁组织（A）与宫颈癌组织（B）的表达，×200。 标尺=50 μm

表1 RAD51AP1蛋白在宫颈癌组织与癌旁组织的表达（n=51）

2.2 RAD51AP1蛋白在宫颈癌细胞系中的表达

与HUCEC细胞（0.21±0.03）比较，Caski（0.72±0.05）、Hela（0.93±0.08）、C-33A（0.88±0.06）、SiHa（1.09±0.12）4种宫颈癌细胞系中RAD51AP1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），其中SiHa细胞中RAD51AP1蛋白表达水平最高，故选择SiHa细胞系进行后续实验（图2）。

图2 RAD51AP1在宫颈癌细胞系中的表达

2.3 RAD51AP1对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响

与对照组比较，si-RAD51AP1组与抑制剂组细胞增殖活性与cyclin D1蛋白表达水平显著降低，细胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与si-RAD51AP1组比较，si-RAD51AP1+激活剂组细胞增殖活性与cyclin D1蛋白表达水平显著升高，细胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），表明抑制RAD51AP1的表达或使用TGF-β/Smad 通路抑制剂LY2109761均可显著抑制SiHa细胞增殖、促进细胞凋亡，而使用si-RAD51AP1和TGF-β/Smad 通路激活剂共同处理细胞可部分逆转以上变化（图3~5，表2）。

图3 各组SiHa细胞增殖活性检测结果

图4 RAD51AP1对SiHa细胞cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表达的影响

表2 RAD51AP1对SiHa细胞增殖及凋亡的影响（n=6，±s）

表2 RAD51AP1对SiHa细胞增殖及凋亡的影响（n=6，±s）

*P＜0.05 vs对照组；△P＜0.05 vs si-NC组；#P＜0.05 vs si-RAD51AP1组

组别 凋亡率（%） Cyclin D1 Bax Caspase-3 Cleaved caspase 3 RAD51AP1对照组 4.05±0.87 1.03±0.12 0.33±0.03 0.43±0.04 0.21±0.03 1.05±0.12 si-NC组 3.67±0.82 1.01±0.13 0.34±0.04 0.45±0.06 0.23±0.04 1.07±0.11 si-RAD51AP1组 25.31±2.43*△ 0.41±0.05*△ 0.98±0.10*△ 1.04±0.13*△ 0.85±0.10*△ 0.31±0.04*△抑制剂组 28.33±3.06* 0.35±0.04* 1.05±0.11* 1.00±0.12* 0.81±0.08* 1.03±0.11 si-RAD51AP1+激活剂组 11.54±2.04# 0.91±0.09# 0.57±0.06# 0.65±0.08# 0.51±0.05# 0.34±0.03

2.4 RAD51AP1对SiHa细胞克隆形成能力的影响

与对照组[（57.26±4.36）%]比较，si-RAD51AP1组[（32.42±3.79）%]与抑制剂组[（30.50±3.21）%]细 胞 克 隆 形 成 率 显 著降低（P＜0.05）；与si-RAD51AP1组比较，si-RAD51AP1+激活剂组[（45.41±4.05）%]细胞克隆形成率显著升高（P＜0.05）（图6）。

图6 各组SiHa细胞克隆形成图

2.5 RAD51AP1对SiHa细胞中TGF-β/Smad通路的影响

与对照组比较，si-RAD51AP1组与抑制剂组细胞TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋 白 表 达水平显著降低（P＜0.05）；与si-RAD51AP1组比较，si-RAD51AP1+激活剂组细胞TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），表明RAD51AP1可调控TGF-β/Smad 通路蛋白（图7，表3）。

图7 RAD51AP1对SiHa细胞TGF-β1、p-SMAD2、 p-SMAD3蛋白表达的影响

3 讨论

RAD51AP1是DNA同源重组修复的关键蛋白，已有研究报道，RAD51AP1在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中异常表达[7-8]。Zhao等[9]研究表明，卵巢癌中RAD51AP1上调表达，与卵巢癌分期高和患者预后不良有关，在体外下调RAD51AP1表达可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究结果显示，RAD51AP1在宫颈癌组织与细胞系中表达上调，提示RAD51AP1与宫颈癌的发生有关。研究显示[10]，RAD51AP1基因在管腔雌激素受体阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌中表达上调，与预后不良有关。在乳腺癌基因工程小鼠模型中，敲除RAD51AP1基因可减少肿瘤生长和相关肺转移，表明抑制RAD51AP1表达可抑制肿瘤生长与转移。另外，还有研究表明，结直肠癌中RAD51AP1表达上调，可通过调节结直肠癌干细胞（CRCSC）自我更新促进肿瘤生长与化疗耐药性[11]。本研究结果显示，抑制RAD51AP1表达后，细胞增殖活性、细胞克隆形成率与cyclin D1蛋白表达水平显著降低，细胞凋亡率、Bax、caspase-3蛋白表达水平显著升高，表明抑制RAD51AP1表达可抑制SiHa细胞增殖，促进细胞凋亡，但RAD51AP1对SiHa细胞的作用机制尚不清楚。

表3 RAD51AP1对SiHa细胞TGF-β/Smad 通路蛋白表达的影响（n=6，±s）

表3 RAD51AP1对SiHa细胞TGF-β/Smad 通路蛋白表达的影响（n=6，±s）

*P＜0.05 vs对照组；△P＜0.05 vs si-NC组；#P＜0.05 vs si-RAD51AP1组

组别 TGF-β1 p-SMAD2 p-SMAD3对照组 0.98±0.11 1.01±0.10 0.95±0.09 si-NC组 1.00±0.13 1.05±0.11 0.97±0.10 si-RAD51AP1组 0.31±0.04*△ 0.37±0.05*△ 0.40±0.06*△抑制剂组 0.27±0.03* 0.35±0.04* 0.43±0.05*si-RAD51AP1+激活剂组 0.93±0.10# 0.85±0.08# 0.90±0.09#

TGF-β信号通路在调控肿瘤的生长中发挥重要作用，也与肿瘤的转移和侵袭有关。TGF-β有多种亚型，其中人TGF-β1定位于染色体19q3，可诱导肿瘤免疫逃逸、促进血管生成和EMT。Smads蛋白是TGF-β的直接作用底物，其中Smad2/3介导信号传导，在转导过程中被磷酸化，参与TGF-β信号通路[12]。TGF-β1/Smads通路参与肝癌、NSCLC等多种肿瘤细胞增殖与凋亡[13-14]。Chen等[15]研究表明，LncRNA FOXD3-AS1通过上调miR-296-5p和抑制TGF-β1/Smads信号通路活化，抑制甲状腺癌细胞增殖与侵袭。陈春苗等[16]研究表明，在TGF-β1诱导的人肝癌HepG2细胞中，小檗碱可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路，抑制HepG2细胞的迁移和侵袭及EMT进程。本研究发现，SiHa细胞转染si-RAD51AP1或使用TGF-β抑制剂处理后，TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表达水平显著减低，提示抑制RAD51AP1表达与TGF-β/Smad 通路抑制剂的作用效果类似，抑制RAD51AP1表达可抑制TGF-β/Smad 通路。而使用si-RAD51AP1与TGF-β激活剂共同处理细胞后，与单独使用si-RAD51AP1相 比，细 胞 中TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表达水平显著升高，细胞增殖活性、细胞克隆形成率升高，凋亡率降低，证实抑制RAD51AP1表达可通过抑制TGF-β/Smad 通路，抑制宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡，提示通过抑制RAD51AP1表达可能抑制宫颈癌肿瘤的生长，这为宫颈癌的治疗提供了一个方向。研究显示[17]，BRD4抑制剂可通过抑制RAD51AP1转录增加宫颈癌对放疗的敏感性，提示RAD51AP1可能在在宫颈癌治疗中发挥一定的作用。本研究接下来将结合动物模型，研究RAD51AP1对宫颈癌的抑制作用，为宫颈癌的诊治提供理论基础。

综上所述，RAD51AP1在宫颈癌中表达上调，抑制RAD51AP1表达可通过抑制TGF-β/Smad通路抑制宫颈癌生长。