枳椇皮提取物对泌尿结石大鼠肾功能及c-jun氨基末端激酶 信号通路的调节作用及其机制

郑 新 于 斌 李育欣 何 蕊

（天津市第四中心医院泌尿外科，天津 300140）

泌尿结石种类较多，近80%结石由草酸钙构成[1]。常见的治疗方法为手术治疗，但其术后的复发率为60%～80%。此外，外科手术中引起的肾损伤亦是结石治疗过程中不容忽视的。相关研究提出[2]，枳椇皮提取物对肾结石具有一定的治疗作用。枳惧又称鸡脚爪，其籽具有清凉利尿等作用，其皮可活血、舒筋解毒，其果可健胃、补血。经贵州民间长期临床观察证实，枳椇皮对肾结石具有较好的治疗效果。c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）是位于细胞质的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导的JNK信号通路与细胞增殖、凋亡、细胞应激等多种生理活动密切相关，是机体内重要的信号通路。多种肾脏疾病与JNK信号通路及其相关蛋白的异常表达密切相关。已有研究证实[3]JNK信号通路对于糖尿病引起的肾损伤具有一定的治疗作用。另外研究发现[4]，JNK在草酸钙结石中表现为异常高表达，激活的JNK通过调节JNK通路的相关蛋白可诱导肾小管上皮细胞凋亡的发生，影响肾功能。由于近80%的泌尿结石为肾结石，因此本文建立肾结石大鼠模型，研究枳椇皮提取物对肾结石大鼠肾功能及JNK信号通路的调节作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

选取SPF级健康SD大鼠55只，体质量200~300 g，由长沙市海天勤公司提供[生产许可证号：SCXK（湘）-2019-0002]。常规饲养，自由饮食饮水。随机将大鼠分为对照组（健康大鼠）、模型组（泌尿结石大鼠模型组）、低剂量组（泌尿结石大鼠模型+15 mg/kg枳椇皮提取物）、高剂量组（泌尿结石大鼠模型+25 mg/kg枳椇皮提取物）、排石组（排石颗粒药物对照），每组11只。

1.2 实验试剂

枳椇皮采自贵州省，经专家鉴定为鼠李科植物枳椇的树皮部分；排石颗粒（江西南昌济生制药厂 ）；p-JNK、JNK一抗（广州丹麦公司）；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)试剂盒（上海雅吉公司）；TUNEL试剂盒（西安东澳公司）；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine，Cr）试剂盒（长春汇力公司）。

1.3 枳椇皮提取物制备

取枳椇皮100 g，蒸馏水提取2次，取提取液，浓缩至浸膏，干燥至粉末。使用前，取部分粉末溶于水中按所需浓度配置。

1.4 模型建立及给药

对照组大鼠给予常规饲养，其余各组大鼠给予1%乙二醇去离子水作为大鼠的唯一饮用水源并自由饮用，以制作肾结石模型[5]。建模成功后，对照组及模型组大鼠给予2 mL/d蒸馏水灌胃，低、高剂量组分别给予15 mg/kg、25 mg/kg枳椇皮提取物灌胃，排石组给予100 mg/kg排石颗粒灌胃。4周后结束灌胃。

1.5 H-E染色观察大鼠肾组织病理形态

实验结束后，收集大鼠24 h空腹尿量，显微镜下观察草酸钙结晶。而后处死各组大鼠，切取左侧肾组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规制作切片，并进行H-E染色，最后以中性树胶封片，在偏光显微镜下观察大鼠肾组织的病理改变。

1.6 比色法检测各组大鼠肾功能指标水平

断头处死各组大鼠，经腹主动脉采集各组大鼠血液样本5 mL，以3 000 r/min离心10 min，将上清冻存于-20℃冰箱，用比色法检测血清BUN和Cr水平。

1.7 TUNEL法检测各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡

取各组大鼠肾组织石蜡切片脱蜡，加入20 μg/mL不含核酸内切酶的蛋白酶K工作液处理组织37℃反应15 min，蛋白酶K通透后，4%多聚甲醛浸泡5 min，100 µL平衡缓冲液室温5 min，加100 µL TdT反应混合液，置湿盒中，37℃反应1 h，加50 μL convertr-POD，常温无光孵育0.5 h，PBS清洗，DAB液显色，冲洗，苏木精复染，脱水透明、封片。以细胞核呈棕褐色为凋亡阳性细胞的判定标准。取5个高倍视野，计数细胞中的阳性细胞，细胞凋亡率=凋亡阳性细胞数/总细胞数。

1.8 免疫组织化学检测各组大鼠肾组织p-JNK、JNK表达

大鼠断头处死后分离肾，用4%多聚甲醛固定，室温下静置10 min，石蜡包埋、切片，经脱蜡、水化、封闭、抗原修复、封闭后，37℃放置30 min，滴加稀释的p-JNK、JNK一抗（1∶200），4℃过夜。次日加人二抗（1∶1 000）及SABC（1∶1 500），室温DAB显色，封片后显微镜观察。

1.9 各组大鼠肾组织SOD、MDA水平检测

取各组大鼠肾组织，将其制成匀浆后离心10 min。黄嘌呤氧化酶法检测肾组织SOD水平，TBA法测定肾组织MDA水平，严格按照说明书操作。

1.10 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肾组织形态

草酸钙结晶多呈现菱形。模型组大鼠尿液中的草酸钙结晶明显排出较少，低、高剂量组与排石组草酸钙结晶排出量均较模型组高，且以高剂量组效果最佳。H-E染色可见，对照组大鼠肾组织结构正常；模型组大鼠肾小管上皮细胞发生坏死，有大量炎症细胞浸润，管腔中可见明显的结石结晶，部分肾小球发生明显的萎缩；低剂量组大鼠部分肾小管上皮细胞坏死，管腔中可见少量结石结晶，周围炎症细胞浸润有所减少，肾小球未见明显萎缩；高剂量组大鼠肾小管上皮细胞未发生肿胀及坏死，管腔未有结石，无炎症细胞浸润，肾小球未发生萎缩；排石组大鼠肾小管上皮细胞有些轻微的肿胀，未见坏死，管腔中未见结石，肾间质未见炎症细胞浸润，肾小球未发生萎缩（图1）。

2.2 各组大鼠肾功能指标水平比较

模型组大鼠血BUN、Cr水平较对照组高（P＜0.05），低剂量组血BUN、Cr水平较模型组低（P＜0.05）。高剂量组与排石组血BUN、Cr水平较低剂量组低（P＜0.05）。高剂量组与排石组血BUN、Cr水平差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 各组大鼠血清BUN、Cr水平比较（n=11，±s）

表1 各组大鼠血清BUN、Cr水平比较（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 对照组；#P＜0.05 vs 模型组；△P＜0.05 vs低剂量组

组别 BUN（mmol/L） Cr（μmol/L）对照组 3.01±0.42 162.27±20.34模型组 7.28±1.05* 234.59±31.45*低剂量组 5.82±0.59*# 201.37±24.82*#高剂量组 3.65±0.37*#△ 162.49±22.17*#△排石组 4.05±0.41*#△ 171.52±31.22*#△

2.3 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡比较

对照组、模型组、低剂量组、高剂量组与排石组大鼠肾小管上皮细胞凋亡率分别为4.27%±0.31%、30.45%±3.26%、17.24%±1.15%、12.45%±1.03%、13.11%±0.84%。模型组大鼠肾小管上皮细胞凋亡率高于对照组（P＜0.05），低剂量组低于模型组（P＜0.05），高剂量组和排石组低于低剂量组（P＜0.05），而高剂量组和排石组差异无统计学意义（P＜0.05）（图2）。

2.4 各组大鼠肾组织p-JNK、JNK水平比较

模型组大鼠肾组织p-JNK、JNK水平高于对照组（P＜0.05），低剂量组低于模型组（P＜0.05），高剂量组和排石组低于低剂量组（P＜0.05），而高剂量组与排石组p-JNK、JNK水平差异无统计学意义（P＞0.05）（表2，图3）。

表2 各组大鼠肾组织p-JNK、JNK水平比较（n=11，±s）

表2 各组大鼠肾组织p-JNK、JNK水平比较（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 对照组；#P＜0.05 vs 模型组；△P＜0.05 vs低剂量组

组别 p-JNK JNK对照组 2.23±0.14 2.52±0.17模型组 7.65±0.82* 7.95±0.84*低剂量组 5.71±0.58*# 6.43±0.58*#高剂量组 3.62±0.27*#△ 3.94±0.41*#△排石组 4.24±0.33*#△ 4.25±0.37*#△

2.5 各组大鼠肾组织SOD、MDA水平比较

与对照组相比，模型组大鼠肾组织中SOD降低、MDA升高（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组大鼠SOD升高、MDA降低（P＜0.05）；与低剂量组相比，高剂量组与排石组SOD升高、MDA降低（P＜0.05），高剂量组与排石组SOD、MDA水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 各组大鼠肾组织SOD、MDA水平比较（n=11，±s）

表3 各组大鼠肾组织SOD、MDA水平比较（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 对照组；#P＜0.05 vs 模型组；△P＜0.05 vs低剂量组

组别 SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot）对照组 65.26±6.17 0.56±0.04模型组 32.47±4.52* 1.98±0.21*低剂量组 46.38±3.96*# 1.09±0.18*#高剂量组 63.47±5.88*#△ 0.67±0.08*#△排石组 59.56±7.49*#△ 0.73±0.05*#△

3 讨论

肾结石是一种常见的、复发性疾病，在亚洲其患病率为2%～5%，而在欧洲和北美洲其患病率高达8%～15%，草酸钙是肾结石的主要成分，约占肾结石成分的80%[6]。在中国至少有一亿多人口患肾结石疾病[7]。西医对于该病的治疗多采用手术的方式，但术后复发率较高，中医运用对症治疗的方式，改善体质、消除结石，从而起到治疗作用。

图1 各组大鼠H-E染色结果。A：对照组；B： 模型组；C：低剂量组；D： 高剂量组；E： 排石组。A1~E1：标尺=100 μm，×100；A2~E2：标尺=25 μm，×400.图2 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况，标尺=50 μm。A：对照组；B： 模型组；C：低剂量组；D： 高剂量组；E： 排石组.图3 各组大鼠肾组织中p-JNK（A1~E1）、JNK（A2~E2）水平对比，标尺=50 μm，×200。A：对照组；B： 模型组；C：低剂量组；D： 高剂量组；E： 排石组.

尿液过饱和导致晶体于肾上皮细胞黏附是肾结石产生的一个过程。肾上皮细胞黏附导致晶体滞留管腔并堆积形成晶体，最终形成肾结石。细胞损伤是细胞黏附的基础病理条件。当细胞损伤后，会有大量带负电荷的分子产生，这些分子可吸附带正电荷的草酸钙结晶，同时还可使细胞产生自由基，通过氧化损伤进一步损伤肾上皮细胞，形成恶性循环，导致肾结石产生[8-9]。活性氧的过量生成或体内抗氧化水平的降低，将导致氧化应激和炎症损伤，并通过促进肾小管上皮细胞损伤参与结石的生成。MDA、SOD是临床上常用反应机体氧化应激损伤程度的指标，MDA是氧自由基氧化后的产物，SOD为抗氧化物。枳椇具有清凉利尿等作用，在贵州等地常用其皮泡水用于治疗结石，经长期临床观察，发现其具有一定的治疗效果。本研究结果显示，枳椇皮提取物可有效减少肾上皮细胞的凋亡、促进草酸钙结晶的排出并改善氧化应激状态。颜春鲁等[10]研究证实了通过减少氧化应激损伤可有效抑制肾结石形成。柳海艳等[11]在对酒精肝的实验研究中提出，枳椇籽具有提高模型大鼠抗氧化的功能。任群利等[12]在对肾结石大鼠的研究中提出，通过运用枳椇皮提取物干预后，发现大鼠尿液中排出大量草酸钙结晶，且组织病理形态显示病情有所改善。本研究结果与上述研究结果相似。

内质网是细胞内加工蛋白质的重要细胞器，当病理损伤因素持续存在时，会引起内质网跨膜蛋白分离并通过下游信号转导途径引起组织损伤。JNK是JNK信号通路的关键蛋白，JNK蛋白以磷酸化形式激活，并影响下游相关蛋白的表达[13-14]。JNK通路是内质网应激的下游通路之一，内质网应激通过促进p-JNK增加促凋亡蛋白因子水平，导致肾小管上皮细胞凋亡，加重肾结石严重程度，影响肾功能[15-16]。BUN、Cr是反映肾功能损伤程度的指标[17-18]。本研究发现枳椇皮可有效降低p-JNK、JNK水平，并可改善大鼠肾功能损伤，这与任群利[12]等对肾结石大鼠的研究结果相似。兰天[19]等在对糖尿病肾病大鼠的研究中提出，JNK水平升高可促进足细胞凋亡，进而诱导肾小球滤过功能障碍。贺德华[20]等对肾结石大鼠的研究证实，汉黄芩通过调控JNK信号通路，改善大鼠肾功能。本研究与上述研究结果相似。

综上所述，枳椇皮提取物通过降低JNK水平，减少肾小管上皮细胞的凋亡，降低氧化损伤，从而改善泌尿结石大鼠肾功能。