四川省甘孜县部分牦牛肉致病菌及寄生虫的检测分析

古丽香，金 凡，苏春丽，杨天龙，蔡 炯，杨 红，韩 琴*

(1.成都医学院公共卫生学院,四川成都 610500；2.成都市食品药品检验研究院，四川成都 611130)

食源性疾病是全世界的重大公共卫生问题。世界卫生组织 (WHO) 表示，因食用受污染的食物每年会导致 200余种疾病，约有200万人死亡。根据对我国2010—2016年发生的家庭食源性疾病统计结果显示，共发生5 197 起，累计发病数 29 210 例，平均每年发病数约4 173例，死亡780 例，病死率为2.7%，且发病数呈逐年上升趋势[1]。食源性疾病主要是指人们通过进食而造成毒害物质或者生物性病原体等致病因子进入体内，进而引发的疾病。当前，细菌性微生物是导致食源性疾病暴发的重要原因[2-3]。而肉类在食品致病微生物污染中最为常见[4]，因其富含蛋白质以及多种营养物质，为致病微生物提供了良好的生存、繁殖环境，而且微生物能够在肉制品中保留更久，在食用前若未进行加热，则易引发多种疾病[5]。在这种情况下，肉类食品成为微生物的天然培养基，极易引起食源性疾病。

在肉类中常见的致病菌有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌0157：H7等。沙门氏菌在外环境中的生存能力较强, 在肉类食品中能生存数月，是感染人类和动物的常见肠道细菌病原体。据报道，在我国发生的128起沙门氏菌食物中毒事件中，由肉类食品引发的有108件，占总起数的84.3%，其中牛肉占32%[6]。而单增李斯特氏菌可在 4 ℃冰箱中生长繁殖，并且冷藏时间越长，危险性越高，在各种食品中均可造成污染，尤其是在肉类食品中，污染率高达10%～30%,其主要感染对象为免疫力低下人群，致死率较高[7-8]。金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，由于其肠毒素致病力较强，由其引起的病人往往出现较为严重的食物中毒症状。美国疾控中心研究报告中指出，由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病占第2位，仅次于大肠杆菌。此外，寄生虫也是引起食源性疾病的重要因素之一。它是一类寄生在人体或者其他动物体内的微生物，经食物、水或土壤等传播可导致寄生虫病，严重威胁人的生命健康。寄生虫的种类较多，主要是肉源性的带绦虫、旋毛虫等危害较为严重[9]。除此之外，一些寄生虫病为人畜共患病，包括猪、牛肉的囊尾蚴、旋毛虫、棘球蚴、弓形虫等，是影响人们健康公共卫生问题之一。

甘孜县拥有天然草场约37.8万hm2,是四川省重要的畜牧业生产基地，凭借天然资源的优势,造就了牦牛这一优良畜种。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪的特点，富含维生素、矿物质及人体必需氨基酸，其营养价值远远高于其他牛肉[10]。近年来，随着人们生活水平的提高及饮食习惯的改变，营养保健、绿色无污染的食品受到消费者的青睐。因此，牦牛肉逐渐成为市场开发的热点，而牦牛养殖业已成为甘孜县广大农民脱贫致富的一项支柱产业。随着牦牛肉及肉制品在居民膳食结构中的比重越来越大，其卫生安全状况也备受消费者关注。因此，为了解常见食源性致病菌如沙门菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157：H7 及寄生虫对四川省甘孜县夺多乡牦牛肉的污染情况，笔者进行了检测分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集2020年9月至2021年11月自四川省甘孜县雪域蓝天养殖加工合作社采集样品，该养殖合作社包括甘孜县夺多乡等乡镇，采集新鲜牦牛肉和风干牦牛肉共5批，共计138份，其中鲜牦牛肉78份，风干牦牛肉60份，采样时间为每年9—12月，按照无菌操作采集样品，每份最小采样量为 500 g，置于无菌封口袋中，在冷藏条件下送至四川省成都市食品药品检验研究院检测。

1.2 试剂和仪器无菌生理盐水、BPW 增菌液、TTB增菌液、SC 增菌液、BS 琼脂、 LB1 增菌液、 LB2增菌液、 XLD琼脂、 CT-SMAC琼脂、 PALCAM 琼脂培养基、Baird-Parker 琼脂平板、改良 EC 肉汤( mEC+n )、TSI琼脂、MUG-LST，单增李斯特氏菌显色培养基、大肠埃希氏菌 O157 显色培养基等。显微镜、振荡器、无菌培养皿、无菌均质器、无菌试管、恒温培养箱、恒温水浴箱、厌氧培养装置等。

1.3 食源性致病菌检测项目及方法检测冷冻鲜牦牛肉及风干牦牛肉中沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌0157：H7的污染情况。 根据 GB 4789.4—2016《中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》[11]，GB 4789.10—2016《中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[12]，GB4789.30—2016《中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》[13],GB 4789.36—2016 《中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》[14]，对其进行处理及检测。

1.4 寄生虫检测按照《国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》操作。按照随机采样原则，从每批鲜肉中抽取腿部肌肉、横膈膜肌肉和肋间肌肉各6份进行检测，根据不同种类寄生虫分别采取剖检法、饱和盐水浮聚法、压片法、沉淀法等进行检测，检测牛带绦虫、棘球蚴和旋毛虫。

1.4.1饱和盐水浮聚法。采用饱和盐水浮聚法检测牛带绦虫。将适量NaCl 溶于水中煮沸，直至不能溶解为止，将其静置冷却，有少量盐析出，所得溶液即为饱和盐水。取鲜牦牛肉500 g，加入适量饱和盐水，清洗牛肉表面2～3遍，将清洗过的水倒入锥形瓶中，用胶头滴管滴至瓶口稍高出但不溢出的状态。在瓶口覆盖一载玻片，使其与液面完全接触但无气泡产生，静置 25 min。平提载玻片并迅速翻转，盖上盖玻片，不存有气泡，置显微镜下观察。

1.4.2水洗沉淀法 。采用水洗沉淀法检测棘球蚴。使用去离子水清洗牦牛肉表面，将清洗过的水倒入倒三角瓶中，静置 30 min 后倾去上清，保留沉淀。再加满去离子水，静置30 min，倾去上清液，保留沉淀。反复 1～3 次直至上清澄清后转至 50 mL 量杯中，再加蒸馏水重复清洗沉渣1～2次，每次均须静置30 min，倒去上清液留下2～3 mL下层沉淀。最后用滴管吸取适量沉淀涂于载玻片上，置显微镜下观察。

1.4.3直接剖检法。将清洗过的牦牛肉置于解剖盘中，用刀顺着纹理方向切开，选择不同部位及深度进行检查，肉眼观察牦牛肉上是否有虫体或囊包。发现虫体或囊包后取出镜检，在显微镜下根据特征进行鉴定。

1.4.4压片法。采用压片法检测旋毛虫。顺着牦牛肉肌肉纹理方向剪取不同部位约0.2 g，置于载玻片上，并滴加碱性品红染液，盖上另一张载玻片。将2张载玻片挤压成薄膜，置显微镜下观察。

1.5 数据统计分析应用 WPS Excel 对检测数据进行分析，统计寄生虫检出率。

检出率=检出数/样本数×100%

2 结果与分析

2.1 牦牛肉食品致病菌检测结果鲜肉及肉制品中致病菌污染的原因除牦牛本身带菌、饲养环境卫生条件差外，在屠宰、加工和储藏过程中肉品也会受到污染。对甘孜县冷冻鲜牦牛肉及风干牦牛肉进行检测，结果显示，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌0157：H7 4种致病菌的检测结果均符合国家肉类卫生合格标准(表1、图1～6)。

表 1 四川省甘孜县牦牛肉 4 种致病菌检出情况

图 1 沙门氏菌在XLD和BS平板上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of Salmonella on both XLD and BS plates

注：A.沙门氏菌在三糖铁琼脂的反应结果(K.产碱;A.产酸；+.阳性;-.阴性 )；B.沙门氏菌在生化鉴定条上的反应结果，样品可判定为沙门氏菌阴性Note:A.The reaction results of Salmonella in trisaccharide iron agar (K.Alkali production; A.Acid production;+.Positive; -.Negative); B.The reaction result of Salmonella on the biochemical identification strip, the sample can be judged as Salmonella negative图2 沙门氏菌的生化鉴定结果Fig.2 Biochemical identification results of Salmonella

图3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上的菌落形态Fig.3 Colony morphology of S.aureus on Baird-Parker plates

图4 单增李斯特氏菌在PALCAM平板和单增李斯特氏菌显色平板上的菌落形态Fig.4 Colony morphology of Listeria monocytogenes on PALCAM plate and Listeria chromogenic plate

图5 大肠埃希氏菌0157在CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌 0157 显色平板上的菌落形态Fig.5 Colony morphology of Escherichia coli 0157 on CT-SMAC plate and Escherichia coli 0157 color plate

注：A.大肠埃希氏菌0157：H7在三糖铁琼脂的反应结果(K.产碱;A.产酸；+.阳性;-.阴性)；B.大肠埃希氏菌0157：H7在生化鉴定条上的反应结果，样品可判定为大肠埃希氏菌0157：H7阴性Note:A.The reaction results of Escherichia coli 0157: H7 in trisaccharide iron agar (K.Alkali production;A.Acid production; +.Positive; -.Negative); B.The reaction result of Escherichia coli 0157: H7 on the biochemical identification strip, the sample can be judged as negative for Escherichia coli 0157: H7图6 大肠埃希氏菌0157：H7的生化鉴定结果Fig.6 Results of biochemical identification of Escherichia coli 0157: H7

2.2 鲜牦牛肉寄生虫检测结果30份冷冻鲜牦牛肉中均未检出牛带绦虫、棘球蚴和旋毛虫。顺着牦牛肉纹理方向将肉表层及深层划开，肉眼观察牛肉表面、浅表及深层内部，并置于显微镜下观察，肉眼及镜下均未发现牛带绦虫、棘球蚴和旋毛虫(图7)。

注：A.饱和盐水浮聚法检测牛带绦虫；B.沉淀法检测棘球蚴；C.压片法检测旋毛虫;D.切开牦牛腿肉，横膈膜肌及肋间肌肉,肉眼观察并未发现囊尾蚴Note:A.Taenia by saturated saline; B.Cercariae by precipitation; C.Trichellae by pressure plate;D.No cysticercus was found in the diaphragmatic muscle and intercostal muscle after incision of yak leg meat图7 显微镜下冷冻鲜牦牛肉寄生虫检测结果(10×10)Fig.7 Observation results of parasites in frozen fresh yak meat under microscope (10×10)

3 讨论

食源性致病菌和寄生虫污染是食物中毒和食源性疾病暴发的重要因素，是当前食品安全的主要风险隐患。除食品本身是致病菌的携带者外，在屠宰、加工和储藏过程中肉品也会受到污染。由四川省甘孜县夺多乡冷冻鲜牦牛肉和风干牦牛肉的食源性致病菌检验结果可知，沙门氏菌、单增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌0157：H7检验结果均在国家食品安全标准范围内。在甘孜县牦牛肉及肉制品中虽未检出致病菌，但我国各地调查数据显示，牛肉及肉制品仍存在着被食源性致病菌污染的情况。如天祝白牦牛肉中金黄色葡萄球菌的检出率为14.7%[15]，新疆乌鲁木齐地区零售生牛肉中沙门氏菌的感染率达到6.44%[16]。而在各类零售肉产品中也检测出大肠埃希菌0157：H7，主要包括牛肉产品[17-18]。此外，在上海地区市售生鲜肉中食源性致病菌的调查结果显示，鲜牛肉的单增生李斯特氏菌检出率也非常高，达到48.0%，高于鲜猪肉(17.5%)和整鸡(19.6%)[19]。因此，对牦牛肉及肉制品中的食源性致病菌污染仍不能放松警惕。

随着牦牛养殖量的不断增加，牦牛养殖相对集中，交通运输交易频繁，给寄生虫病的传播感染也提供了更多机会。寄生虫感染会造成牦牛生长缓慢，生产性能降低，甚至引起继发感染导致死亡，造成严重损失。除此之外，它们也能够作为病原引起疾病及作为疾病的传播媒介，严重威胁人民生命健康[20]。带绦虫病被世界卫生组织列为十大危害食源性寄生虫病之一，它不仅会造成人体残疾，还会危及生命。据报道，我国带绦虫病总感染率为0.06%，感染数约37万例，感染率居前3位的包括四川省(0.18%)[21]。旋毛虫病呈全球性分布，主要是因生食或半生食含旋毛虫幼虫囊包的肉类而感染。因此，在喜生食或半生食肉的国家和地区，经常会暴发感染事件[22]。棘球蚴素有 “虫癌” 之称，包囊好发于肝脏、 肺脏和脑部，几乎可造成所有脏器和组织的损害，危害大， 病死率高[23]。我国第2次人体重要寄生虫病现状调查报告显示，带绦虫、棘球蚴和旋毛虫病感染率仍较严重，与第1次调查结果相比，四川省带绦虫感染率上升幅度最为明显, 高达98%[24]。此外，四川省也是棘球蚴病(俗称包虫病)的高发区之一，主要流行于甘孜州和阿坝州的31个县。棘球蚴成虫寄生在犬科动物小肠，其虫卵或孕卵节片随粪便排出污染水、草及环境，在放牧过程中，牦牛因食入虫卵而被感染，造成当地牦牛棘球蚴感染率较高[25]。笔者在甘孜县的冷冻鲜牦牛肉中未检出寄生虫污染，说明四川省甘孜县近年来的防治措施取得了一定成效，但仍需持续和重点关注感染率较高的重点人群和重点地区。

该研究中，在甘孜县冷冻鲜牦牛肉及其肉制品中虽未检出食源性致病菌和寄生虫污染，但仍不能松懈，相关部门应对牦牛肉养殖及生产加工全过程进行严格管控，加强相关操作人员的食品卫生知识培训，提高卫生意识。同时，政府应加大监督力度，以确保肉制品安全，切断传播及感染途径，防止食源性疾病暴发。