孕妇产前血清学检查抗G抗体鉴定与分析

黄靓 刘丹 凤维杰 刘盼盼

新生儿溶血病（HDN）是由于母婴血型不合引起的胎儿或新生儿免疫性溶血性疾病，黄疸、贫血、肝脾肿大等为其主要症状，严重者甚至可能发生胆红素脑病，造成神经系统损害，导致听力损伤、智力障碍或发育迟缓等不良后果[1-2]，母婴血型不合新生儿溶血病是母亲体内存在着与胎儿红细胞不相合的IgG型抗体，该抗体发生同种被动免疫，从而引起胎儿或者新生儿免疫性溶血性疾病[3]。孕妇产前血清学抗体检查，能有效预防新生儿溶血，临床存在一些不常见抗体，在临床诊断时容易导致误判，影响临床诊断治疗。比如Rh系统的抗G抗体，其同时表现出抗D和抗C，但是和普通抗D和抗C混合抗体不同。现将近几年本单位在孕妇产前血清抗体检查中发现的同时具有抗D和抗C表现的4例样本中发现2例抗G抗体，做如下报道。

材料与方法

1 临床资料 4例产妇均自述Rh（D）阴性，年龄均在28～33岁之间。丈夫均为Rh（D）阳性，孕期均大于16周，其中2例有孕产史，另外2例无孕产史。4人均无输血史。到我院进行产前检查，做抗体筛查及产前抗体滴度检查。

2 试剂与仪器 ABO试剂红细胞、抗体筛选细胞、IgM抗D抗体、抗E、抗e、抗C、抗c、二巯基乙醇（2-Me）来自上海血液生物医药有限公司；IgM+IgG抗D试剂购自Millipore公司；抗体鉴定细胞（Screening panel 123/Sanquin Reagents B.V公司）；菠萝酶、ABO血型+RhD微柱凝胶血型卡、Bio-Rad IH-1000全自动血型仪、低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡、ID-incubator37SI微柱凝胶离心机都来自Bio-Rad公司；KUBOTA-KA离心机（日本久保田）；水温箱、标本离心机（北京白洋医疗器械公司）。

3 方法

3.1 血型鉴定：采用Bio-Rad IH-1000全自动血型仪及ABO血型+RhD微柱凝胶血型卡，Rh阴性确认试验使用IgM+IgG抗D试剂及低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡，Rh血型系统其他抗原检测，使用抗E、抗e、抗C、抗c抗体，试管法检测。按照《实用血液免疫学血型理论和实验技术》[4]操作指南操作。产妇及其丈夫血型结果见表1。

表1 孕妇及其丈夫血型鉴定结果

3.2 抗体筛选及抗体鉴定：抗体筛选试验采用Bio-Rad IH-1000全自动血型仪及低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡，抗体鉴定采用低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡，抗体鉴定细胞和微柱凝胶离心机，按照《临床输血与输血技术学实验指导》[5]操作方法，抗筛结果均阳性，抗体均表现出抗D和抗C格局，具体见表2。

3.3 吸收放散试验及抗G抗体鉴定：抗G抗体鉴定，采取两步吸收放散方法，吸收试验前使用Ccdee细胞需做吸收放散试验，排除Del型存在。第一步吸收试验：选取O型Rh表型为ccDEE的三洗后酶处理红细胞与产妇血清37℃吸收2 h，吸收后红细胞有抗体结合，直抗阳性。吸收后血清，使用谱细胞中ccDee和CCdee的细胞检测其抗体，2例检测出抗C抗体，另2例抗C抗体为阴性，均未检出抗D抗体。第一步洗脱放散试验：利用冷柠檬酸放散技术，对第一步吸收后红细胞洗脱放散，使用谱细胞中ccDee和CCdee的细胞检测放散液抗体，其中3例抗D阳性，一例抗D阴性，抗C均阴性。第二步吸收试验：取第一步洗脱放散后放散液与O型Rh表型为Ccdee三洗后酶处理红细胞37℃吸收2小时，吸收后红细胞，2例为直抗弱阳性，2例为直抗阴性。利用谱细胞中ccDee和CCdee细胞检测吸收后放散液抗体，3例抗D阳性，1例阴性，抗C均阴性。第二步洗脱放散试验：利用冷柠檬酸放散技术对第二步吸收后红细胞洗脱放散，使用谱细胞中ccDee和CCdee的细胞检测放散液抗体，2例抗D、抗C均阴性，2例抗D、抗C均为阳性，后两例的表现为抗G。吸收及冷柠檬酸放散技术均根据《实用血液免疫学血型理论和实验技术》[4]指南操作，抗体鉴定利用微柱凝胶卡式法鉴定，操作按照《临床输血与输血技术学实验指导》[5]操作方法。具体试验路线图见图1。

图1 吸收放散试验流程图

3.4 抗体效价检测：对2例判断为抗G抗体的产妇血清，利用O型Rh表型为ccDEE和CCdee的细胞，分别对其表现出抗D和抗C性质抗体效价检测，并利用ccDEE的三洗后酶处理红细胞与产妇血清37℃反复吸收后，做ABO抗体效价，操作按照《临床输血与输血技术学实验指导》[5]操作方法。

3.5 新生儿溶血试验：本次报道仅收集到3号产妇新生儿标本，血型鉴定，Rh血型系统其他抗原检测，均采用上文方法。新生儿溶血试验按照《临床输血与输血技术学实验指导》[5]操作方法。

结 果

1 抗G抗体鉴定及效价测定 通过本试验设计的2步吸收放散法，在4例同时表现抗D及抗C格局孕妇血清中，成功鉴定2例含有抗G抗体，并分别鉴定其效价，具体见表2。并且在本试验设计中发现在某些抗体效价较高时，吸收试验短时间无法吸收完全，可以靠两步吸收放散有效加以区别和验证。比如本文中样本3，由于抗G抗体效价较高，导致第一步在短时间内无法做到完全吸收，出现吸收后血清与D抗原仍有反应，但是在第二步吸收放散中就可以得到验证，因为第一步放散液中放散的抗G抗体效价得到降低，因此通过第二步吸收后，可以验证其不含抗D。降低了吸收试验中反复多次吸收，相对以往试验设计有效地节约了时间。根据本次试验经验总结，将常见：抗G+抗D+抗C、抗G+抗D、抗G+抗C、抗D+抗C、单独抗G预期试验格局汇总，见表3。

表2 吸收放散及抗体效价结果

表3 常见抗G抗体试验格局

2 新生儿溶血鉴定及治疗 结合孕妇产前抗G抗体鉴定结果，能有效鉴定抗G引起的新生儿溶血，避免误判，3号孕妇新生儿ABO血型为A型，Rh血型不含C抗原，在新生儿溶血试验时，抗C反应极弱，极易漏检，最初选取Ccdee A型红细胞做新生儿溶血，结果阳性，怀疑ABO溶血。后结合病历，发现其母亲抗体鉴定结果，选取ccdee A型红细胞鉴定为阴性，具体结果见表4。因此当一个ccdee孕妇抗体鉴定表现出抗D和抗C时，尤其抗C反应较弱时，且其新生儿血型不含C抗原时，尤其要注意抗G存在的可能性。该患儿住院期间未做新生儿换血治疗，仅做蓝光治疗，住院期间申请红细胞0.5 U，给予A型D-、C-红细胞0.5 U，输血后无不良反应，Hb由输血前87 g/L提高到101 g/L，数日后胆红素等指标正常出院。若未对孕妇抗G有效鉴定，则会发生误判，影响临床诊疗。

表4 新生儿血清学检测

讨 论

Rh血型系统抗体可导致胎儿和新生儿的溶血性疾病（HDFN），而Rh血型系统是目前人类血型系统研究中最具复杂性和多态性的系统，其中RhD和RhCE基因密切相关、高度同源，是造成其多态性复杂性的重要原因。G抗原就是1种独特的Rh抗原，最

早由ALLEN和TIPPETT描述[6]，RhD和RhCE 的C等

位基因所编码的Ser103是G活性的关键[7]，所有针对Ser103位特异性的抗体都能与RhD和C等位基因的产物反应，这就是抗G而非抗C，通常带有D或者C抗原的红细胞都含有G抗原，故临床上抗G抗体一般是由ccdee个体产生，一般带有抗D和（或）抗C，这样就涉及3种抗体，抗D、抗C和抗G，在临床检测时就会出现5种抗体鉴定可能表现为同一种格局：抗G+抗D+抗C、抗G+抗D、抗G+抗C、抗D+抗C、单独抗G。这种复杂现象极易给鉴定带来混淆和误判，尤其在不含C抗原新生儿，由抗G抗体导致的新生儿溶血中。因此如何有效鉴别抗G对临床检测工作提出了挑战，早期有报道用rG/dce或r''G/dce细胞放散分离方法确定G抗体，但是这种细胞极其稀少[8]，有文献报道，采用ccDee和CCdee细胞吸收放散试验来确定抗G[9]，但是无论是ccDee还是CCdee在我国人群比例均不是太高，如张爱等报道福州地区献血人群Rh血型分布中ccDee仅占D阳性人群的0.25%，而CCdee也仅占阴性人群的7.03%，不太容易获取。而ccDEE占D阳性人群的6.57%，Ccdee占阴性人群的34.35%[10]。因此，本次试验中尝试应用ccDEE和Ccdee细胞，做吸收放散，通过两步吸收放散试验，分别检测吸收后血清和放散液抗体，并结合吸收后红细胞直接抗人球蛋白试验结果。有效地区别了抗D、抗C及抗G。试验中要注意的是，有很多文献报道Ccdee细胞存在Del的情况，如章旭和李晓丰等在RhD*1227A等位基因在辽宁汉族Rh阴性人群和随机人群中的频率分析中报道[11]，在117名Rh阴性人群中20例Ccdee含RhD*1227A等位基因，其中18例吸收放散证实为Del型，因此在使用Ccdee细胞时，要加做吸收放散试验，确定是否为Del，避免在试验中造成失误。

另外在测定抗G抗体效价时，SKOV[12]曾报道Rh表型上G抗原位点数，结果显示DCe/DCe 9900-12200；dCe/dCe 8200-9700；DCE/DCE 5400；DcE/DcE 3600-5800；Dce/Dce 4500- 5300；DcE/dce 4200。因此JUDD等曾指出，比较抗C和抗D的滴度时，推荐r'r'和R2R2检测细胞[13]，JIANHUA等也在检测抗G抗体效价时推荐r'r'和R2R2检测细胞[14]。所以在测定抗G抗体效价时最好使用ccDEE和CCdee细胞。SOUMYA等在文献[15]中报道抗G造成的HDN比单纯的Rh系统抗体如抗D等造成的HDN严重，同时有文献报道，抗G抗体与C+红细胞反应更强，而与C-红细胞反应弱[16]，推测抗-G引起HDN的严重程度往往更取决于C抗原，而不是D抗原，这可能与G抗原在C+红细胞上表达更多有关，本例报告中，抗G抗体表达抗C并不高，因此新生儿未严重至换血治疗，也可能与此有关。很多因素，如免疫亚型这些风险抗体及其转移率胎儿，不同类型的FcγR表达效应单核细胞和巨噬细胞，和Rh不相容抗原表达在红细胞的胎儿和新生儿，均可以影响HDFN的发病率[17]，因此抗G抗体及其抗体效价对HDFN的发病率的影响，仍值得大家探讨。虽然国内Rh阴性群体相对较少，而且对于需要输血的患者，在输血前检测中严格区分抗D、抗C和抗G意义不大，但是对于孕产妇而言，区分抗D、抗C和抗G却十分重要，在排除干扰有效检测ABO产前滴度以及抗D免疫球蛋白使用等方面有提示意义。尤其我国开放二胎政策后，受免疫刺激，导致孕产妇抗筛阳性增加的可能性，免疫溶血造成新生儿溶血的风险增加，因此有效区分抗G对于孕妇产前血清学检测及预防新生儿溶血具有一定意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突