冰冻红细胞质量评价指标专家共识

国防科技创新特区重点项目专家组

红细胞在深低温或超低温（-80℃或-196℃）条件下将处于冻结状态，其生理代谢和化学反应几乎完全停止，因此相比4℃冷藏保存，低温冰冻储存的红细胞，其血红蛋白结构、细胞膜状态以及胞内能量物质都几乎不受储存时间的影响，可实现真正意义上的长期保存[1-2]。1987年9月，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准，-80℃条件下甘油化红细胞可冰冻保存10年，VALERI等人也报道了经过21年、37年冰冻保存后的甘油化红细胞在完成复温洗涤处理后质量仍符合临床使用标准[3-4]。目前国内血站通常将冰冻红细胞保存技术应用于Rh阴性和类孟买等稀有血源保存，可有效保存稀缺的血液资源，减少因储存时间短而引起的稀缺血液资源过期报废[5]。近年来，越来越多的血液中心建立了常规红细胞冰冻保存储备库，应对国家重大事件的应急血液保障需求。

然而，在红细胞冻存保存过程中也存在多种储存损伤，其主要来源于添加和去除保护剂过程中的渗透损伤，冰冻过程中的溶液损伤和胞内冰晶损伤，复温过程中的重结晶损伤等[6]。常用的红细胞冻存剂和冻存方法主要有：40%高浓度甘油储存在-65℃及以下冰箱中，20%中浓度甘油储存在-120℃以下的液氮中，14%低浓度甘油储存在-150℃液氮中[1，7]。还可以采用非渗透性冰冻保护剂在冰冻前脱水红细胞，如羟乙基淀粉（Hetastarch，HES）[6-12]，聚乙烯吡啶烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）[13-14]，海藻糖[15-18]和右旋糖酐。与此同时，针对红细胞冻存过程中产生的低温损伤，研究者们尝试探究红细胞低温保存新方法，如开发新型低温保护剂：渗透压调节剂[16-17，21-22]、海藻酸钙水凝胶纤维[13]等；采用红细胞的冰冻干燥新技术胞内递送海藻糖，如冰冻或者渗透压诱导的膜相变、聚合物或者多肽诱导的膜通透性调节剂、溶血素类的成孔剂、脂质体等，或纳米颗粒封装递送、电穿孔及超声辅助等[22-23]；开发冰晶重结晶抑制剂如小分子化合物、高分子聚合物、聚两性电解质及其他纳米材料等[24]。

在面对需大量红细胞资源抢救伤员的自然灾难或战创伤急救等特殊情况时，建立红细胞储备库显得尤为重要。输注具有良好功能的红细胞能够快速改善贫血，纠正重要脏器氧供不足，提高输注疗效。当前冰冻红细胞的价值受到重视，在我国临床应用也越来越普遍，虽目前国家标准GB18469-2012对冰冻解冻去甘油红细胞的质量控制项目和要求进行了规定，提升其安全性，但其中尚未包括提示其输注有效性的诸多质量指标。笔者组织全国临床输血、输血医学及低温生物学等领域专家共同编写了“冰冻红细胞质量评价指标专家共识”，建议在临床及实验室使用冰冻红细胞前抽样检测各项指标，评估冰冻红细胞质量。其意义在于：一方面，保证临床输注冰冻红细胞的安全性和有效性，减少因低温储存损伤引起的输血不良反应；另一方面，为业内研究者们评价和改进新型红细胞低温保存技术提供参考。笔者参考国内外冻存红细胞标准，例如国家标准“全血及成分血质量要求GB18469-2012”、北京市红十字血液中心编撰的《全血成分血质量要求与血液标准化》、国务院卫生行政部门印发的《血站基本标准》、国卫医函【2019】98号附件《血站技术操作规程（2019版）》；还有来源于欧洲输血委员会的译著《血液成分的制备、使用和质量保证指南（第20版）》、《AABB技术手册（第20版）》、FDA及日本红十字会制定相关标准/要求，结合现有临床及实验室制备和使用冰冻红细胞经验，在其质量评价指标及参考范围方面，形成如下专家共识，以期保障临床及应急使用冰冻红细胞输注的安全性和有效性。值得注意的是，本共识中提到的“冰冻红细胞”是指经冻存保护剂冰冻、解冻、复温、洗涤后并重悬，临床使用前的冰冻红细胞。具体内容如下。

1 推荐项目及参考范围[7，25-34]推荐项目包括：红细胞外观、容量与比容、无菌试验、血红蛋白含量及红细胞计数等、洗涤后回收率、甘油残留量、白细胞残留量、游离血红蛋白含量、红细胞渗透脆性、pH值。冻存使用的红细胞制品应符合HIV、HBV、HCV、梅毒感染标志物检测的最终结论均为无反应性， ABO/RhD血型正确定型，ALT正常。

1.1 外观：肉眼观察应无色泽异常、溶血、凝块、气泡等情况；血袋完好，并保留注满冰冻解冻去甘油红细胞经热合的导管至少20 cm。

1.2 容量与比容：来源于200 mL全血：200 mL±20 mL ；来源于300 mL全血：300 mL±30 mL ；来源于400 mL全血：400 mL±40 mL。值得注意的是，容量大小受到洗涤设备的影响，目前设备离心杯容量大多是250 mL±50 mL。红细胞比容：一般要求洗涤后为0.35 ～ 0.70。

1.3 无菌试验：无细菌生长。

1.4 血红蛋白含量及红细胞计数等：来源于200 mL全血：含量为≥16 g；来源于300 mL全血：含量为≥24 g；来源于400 mL 全血：含量为≥32 g。

红细胞计数、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）和红细胞体积分布宽度（RDW）等指标可通过血常规测量得出，数值以一般临床要求为准。

1.5 洗涤后回收率：洗涤后冰冻红细胞回收率≥75%。

冰冻红细胞回收率=[（洗涤后血红蛋白浓度×洗涤后容量）/（冰冻前血红蛋白浓度×洗涤前容量）]× 100%

1.6 甘油残留量：≤10 g/L。

1.7 白细胞残留量：来源于200 mL全血：含量≤2.0×107个；来源于300 mL全血：含量≤3.0×107个；来源于400 mL全血：含量≤4.0×107个。

1.8 游离血红蛋白含量：≤1 g/L。

或者红细胞溶血率≤0.8%，红细胞溶血率（%）=[（1－红细胞比容）×悬浮液游离血红蛋白浓度/总血红蛋白浓度]×100%

1.9 红细胞渗透脆性：红细胞渗透脆性指红细胞在低渗溶液中发生破裂以致溶血的特性，红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗能力与红细胞表面积和体积比值有关，体积越大，该比值越小，抵抗力越小，即渗透脆性越大，可反映冰冻对红细胞膜的影响。红细胞盐水渗透脆性试验可反映红细胞容量与表面积的比例，也与细胞内钠、钾平衡和糖酵解及红细胞生理功能密切相关[35]，若冻融后的红细胞膜结构不稳定，或保存过程中加入保存液时瞬时渗透梯度过高，红细胞脆性增大，对低渗溶液抵抗力小，会使溶血率增高，红细胞破坏严重，无法应用于临床。操作程序推荐参照《全国临床检验操作规程》（第4版）要求[36]。也可以在低渗氯化钠溶液中红细胞50%溶血率时的浓度为渗透脆性测量值[37]，称红细胞中间脆性。该测量值越高，说明红细胞对低渗盐抵抗力越低，渗透脆性越大。根据文献[38-39]，本共识推荐渗透脆性值不宜超过质量百分比浓度为0.56%氯化钠溶液。

1.10 pH值：pH值是影响红细胞能量代谢的重要因素，也是影响红细胞变形性的外部因素之一，凡细胞内的生化改变均受到血液pH值的影响，因此评价冻存红细胞质量时血液pH值应加以监测。有研究发现，随着pH值的下降，红细胞逐渐趋于增大和肿胀。当pH值＜4.0时，红细胞肿胀明显，部分呈溶解现象，出现典型的红细胞鬼影；而当pH值＞9.0时，红细胞则出现皱缩，出现锯齿状红细胞。

血液pH值一般要求为血液酸碱度即血液内氢离子浓度的负对数值，红细胞储存液pH值检测方法通常为离子选择电极法[40]，也可采用血气分析为参考方法。pH值检测结果受温度影响较大，4℃与37℃检测结果会相差1单位pH值，室温检测结果在二者之间[41]。本共识中要求室温下冰冻红细胞使用前pH值在6.0～7.4之间[26]。在洗涤后24 h内使用的冰冻解冻红细胞，一般重悬在生理盐水中，其pH值不要求测试。

2 可选项目及参考范围 根据红细胞冻存原理、文献调研及实验研究，总结出以下指标提示冻存红细胞质量及状态变化，旨在指示红细胞冻存后生理状态以确认洗涤后是否符合输注标准。以下指标可列入冻存红细胞质量评价备选项目。

2.1 血小板残留量：≤1%，残余血小板（%）=（洗涤后血小板总数/洗涤前血小板总数）×100%。

2.2 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）：ATP对维持红细胞膜上钠钾泵的运转、红细胞钙离子内环境的恒定以及红细胞膜脂质的不断更新和启动糖酵解等[40]，均有重要作用。红细胞内ATP与其输注后体内回收率（post-transfusion recovery，PTR）及细胞内氧化应激之间存在显著的相关性[42-43]，是红细胞能量代谢的重要指标。

ATP含量检测有4种方法，包括荧光测定法、肌酸激酶法、高效液相色谱质谱串联分析法和比色法[44]。荧光测定法是国际血液标准化委员会（International Council for Standardization in Haematology，ICSH） 推荐的标准方法，最常用的方法是比色法。考虑到市场上不同试剂盒之间计量方式的差异，可对比冻存后红细胞与其冻存前或新鲜红细胞之间ATP测量值比值。一般推荐冻存后ATP应保留30% ～ 40%以上。

2.3 2，3-二磷酸甘油酸（2， 3-diphosphoglycerate，2，3-DPG） ：2，3-DPG是红细胞内糖酵解途径2，3-二磷酸甘油酸支路的产物，是血红蛋白的变构调节剂[35]。红细胞高浓度2，3-DPG可看作是能量的储备。除此之外，2，3-DPG还与血红蛋白相互作用并影响血红蛋白对氧气的亲和力。2，3-DPG代谢分解导致血红蛋白氧亲和力和红细胞向组织供氧能力降低。2，3-DPG也与细胞内氧化应激具有显著相关性，其含量下降会诱导胞浆内抗氧化物质的形成，最终结果是膜脂质及蛋白质的氧化损伤[40]。

2，3-DPG含量检测方法有等电速率法[46]、甘油示差水解法[47]和分光光度计比色法[48-49]，分光光度计比色法为常用方法。

2.4 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露率：PS暴露与红细胞的促凝活性呈显著正相关，是反映红细胞膜损伤及氧化损伤的重要指标。红细胞膜PS外翻暴露也是导致红细胞凋亡及介导其体内被单核吞噬系统吞噬降解的信号之一。

PS暴露率检测方法有使用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的膜联蛋白-V（Annexin-V）[50]作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，还有一些使用高效液相色谱法[51]，常使用Annexin-V检测PS暴露率。

2.5 半氧饱和度分压P50：血氧饱和度达50%时血液的氧分压称为P50，P50是反应红细胞氧亲和力的常用指标，是呼吸循环的重要生理参数。P50值越小，则红细胞与氧亲和力越大，红细胞与氧的结合能力越强。一般使用全自动血气分析仪检测计算得出。实验室大部分使用基于多波长光度法测定半氧饱和度分压及氧解离曲线。红细胞悬液的pH值、2，3-DPG含量及测量温度等因素均对P50值有影响。常使用血氧分析仪[49，52]测定P50。

表1 冰冻红细胞质量评价指标推荐项目及参考范围

表2 冰冻红细胞质量评价指标可选项目及参考范围

2.6 红细胞变形性：红细胞变形性是影响血液表观黏度和体内微循环及有效灌注的重要因素之一，同时又是红细胞寿命的重要决定因素。红细胞变形性是由细胞膜的黏弹性、胞浆的黏度（内黏度）、细胞的几何形状等内在因素决定的，红细胞粘滞性与其生理功能密切相关。一般来说解冻后的红细胞和新鲜的红细胞一样，为平滑的双凹圆盘状。然而，甘油在洗脱过程中主要由红细胞通过缓慢的被动扩散释放出来，当保护剂浓度不合适或洗涤方式不恰当时，红细胞呈不规则细胞形状萎缩，可见棘球状红细胞。严重时红细胞发生的渗透性变化，可引起大量水进入红细胞。

红细胞的变形能力是影响血液流动和粘滞性的最主要因素，可利用黏度测定法、反向旋转流变仪测定法、微孔滤过法、激光衍射法等间接地估计红细胞群体的平均变形性大小。国内应用最广的是粘性测定法和微孔筛滤法。可采用血液流变学测定仪检测红细胞变形指数、刚性指数和聚集指数等流变学特征[42]。

以上指标可结合必选指标评价冻存红细胞质量变化，若在参考范围内或与新鲜红细胞比较无显著性差异，则预示着较好的细胞形态及生理功能，为冻存红细胞的安全有效输注提供参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

本共识专家委员会由国防科技创新特区重点项目专家组牵头，由全国各地输血医学研究及临床输血等领域专家组成，专家名单如下（以姓氏笔划为序）：

丁国良（东营市中心血站）、于洋（中国人民解放军总医院第一医学中心）、王小慧（中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所）、尹文（中国人民解放军空军军医大学第一附属医院）、付涌水（广州血液中心）、戎霞（广州血液中心）、刘敏霞（中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所）、李翠莹（中国人民解放军空军特色医学中心）、吴涛（中国人民解放军总医院第七医学中心）、汪德清（中国人民解放军总医院第一医学中心）、张雷（天津大学）、张玉华（中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所）、周虹（中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所）、周芙玲（武汉大学中南医院）、查占山（中国人民解放军海军军医大学第一附属医院）、赵刚（中国科学技术大学）、胡兴斌（中国人民解放军空军军医大学第一附属医院）、骆群（中国人民解放军总医院第五医学中心）、袁晓燕（天津大学）、桂嵘（中南大学湘雅三医院）、钱宝华（中国人民解放军海军军医大学第一附属医院）、栾建凤（中国人民解放军东部战区总医院）、黄远帅（西南医科大学附属医院）、梁声强（中国人民解放军联勤保障部队第909医院）、蒋学兵（中国人民解放军总医院第六医学中心）、韩颖（中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所）、詹林盛（中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所）、欧阳锡林（中国人民解放军总医院第四医学中心）