液体有机酸协同牛至香酚对畜禽有益菌和有害菌抑菌性能的研究

2023-01-06作者程皇座胡友军陆信芳赵晓南刘坚

广东饲料 2022年10期

◆作者：程皇座胡友军,2* 陆信芳赵晓南刘坚

◆单位：1.广东酸动力生物科技有限公司创新中心；2.广东酸能生物科技有限公司创新中心

酸制剂具有无毒、无污染、无残留的特性，最初是作为一种风味添加剂使用，用于改善动物饲料的适口性。随着研究的深入，发现酸制剂还具有降低饮水和饲料中的pH 值、降低饲料系酸力、提高消化酶活性、促进营养物质消化、防霉保鲜和抑菌抗病毒作用。特别是在饲料禁抗后，酸制剂良好的抑菌性能受到大家关注。大量研究表明，在畜禽养殖过程中，酸制剂能够抑制多种病原，起到显著抗菌作用，例如甲酸对沙门氏菌、致病弧菌，苯甲酸对大肠杆菌、沙门氏菌，丙酸对真菌、霉菌等均有良好的抑制作用（李成良，2006）。而在动物养殖上应用，Lan 等（2018）在给母猪饲喂0.2%的富马酸、柠檬酸、癸酸组成的酸制剂，发现分娩期肠道乳酸杆菌提高1.2%，哺乳期乳酸杆菌提高2.2%，大肠杆菌降低2.0%。但也有研究表明，有机酸对肠道微生物没有影响，Risley 等（1992）研究表明，有机酸对仔猪胃、空肠、盲肠和结肠中乳酸菌、梭状芽孢杆菌和大肠杆菌数量没有显著影响。可见有机酸抑菌效果并不统一，这可能与有机酸种类、用量、动物健康状态等因素有关。本试验筛选2 种有害菌（大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌）和3种有益菌（凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、丁酸梭菌），研究有机酸单独和协同牛至香酚对其抑制作用，为商品化有机酸在动物生产上的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

液体有机酸：商品名为富酸宝，主要成分为甲酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、丙酸等，由广东酸动力生物科技有限公司提供。

微生物菌：凝结芽孢杆菌粉、嗜酸乳杆菌粉、丁酸梭菌粉，由江西水微新饲料有限公司提供。大肠埃希氏菌液、金黄色葡萄球菌液，购自清远景骏化工贸易有限公司。

牛至香酚：由江西水微新饲料有限公司提供。

1.2 试验设计

1.2.1 试验处理分组

试验分为2 大组，每个大组又分为5 个小组，第1 大组为液体有机酸单独添加，其中分为不同稀释度液体有机酸，分别为0倍、750 倍、1500 倍、2250 倍、3000 倍稀释添加；第2 大组为液体有机酸协同牛至香酚添加，分别为0 倍、750 倍、1500 倍、2250倍、3000 倍稀释添加。

1.2.2 有机酸单独作用菌液制备

先将液体有机酸稀释成0倍（无菌水代替）、750 倍、1500倍、2250 倍、3000 倍。分别吸取20mL 不同稀释度液体有机酸于锥形瓶中，并在装有不同稀释度液体有机酸中添加0.1g 凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、丁酸梭菌和0.2mL 大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌，制成一定含菌浓度（凝结芽孢杆菌含量为5×108CFU/mL，嗜酸乳杆菌含量为5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量为5×106CFU/mL，大肠埃希氏菌含量为5×107CFU/mL，金黄色葡萄球菌含量为 5 ×107CFU/mL）样品，用恒温振荡器200 rpm/min，振荡3min，置室温1h。每个稀释度做3 个重复。

1.2.3 有机酸协同牛至香酚作用菌液制备

先将液体有机酸稀释成0倍（无菌水代替）、750 倍、1500倍、2250 倍、3000 倍。量取10mL不同稀释度液体有机酸于锥形瓶中，再分别加入10mL 牛至香酚，混匀后，再在装有不同稀释度液体有机酸中添加0.1g 凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、丁酸梭菌菌粉和0.2mL 大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌，制成一定含菌浓度（凝结芽孢杆菌含量为5×108CFU/mL，嗜酸乳杆菌含量为5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量为5×106CFU/mL，大肠埃希氏菌含量为5×107CFU/mL，金黄色葡萄球菌含量为 5 ×107CFU/mL）样品，用恒温振荡器200 rpm/min，振荡3min，置室温1h。每个稀释度做3 个重复。

1.2.4 微生物接种培养

将1.2.3 中各稀释度样品在室温存放作用1h 后，以无菌操作方法吸取1mL 充分混匀的样品，注入盛有9mL 灭菌生理盐水试管中，混匀成10-1稀释液。吸取10-1的稀释液1mL 注入盛有9mL 灭菌生理盐水的试管中，混匀成10-2稀释液，按同法依次稀释至10-8稀释液备用，然后将稀释液以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL 充分混匀的样品，注入灭菌平皿中，倾注约15mL 已融化并冷却到45℃左右的琼脂固体培养基，并立即旋摇平皿，使样品与培养基充分混匀。待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，凝结芽孢杆菌于48℃培养箱内培养48h，嗜酸乳杆菌于37℃培养箱内厌氧培养72h，丁酸梭菌于37℃培养箱内厌氧培养48h，大肠埃希氏菌于37℃培养箱内培养24h，金黄色葡萄球菌于37℃培养箱内培养48h，培养结束后进行菌落计数，菌落个数乘以稀释倍数即为1mL 样品中的活菌菌落总数。

1.2.5 菌落计算

菌种存活率为各处理样品中活菌数占无菌水样品中活菌数（凝结芽孢杆菌含量为5×108CFU/mL，嗜酸乳杆菌含量为5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量为50×106CFU/mL，大肠埃希氏菌含量为5×107CFU/mL，金黄色葡萄球菌含量为 5 ×107CFU/mL）的百分比。

2 结果与分析

由表1 可知，液体有机酸作用1h 对嗜酸乳杆菌活菌率具有中等程度抑制作用，活菌率与对照相比均在30%～49%之间，稀释倍数越高活菌率越高；联合添加牛至香酚将极大程度抑制活菌率低至10%。

表1 不同浓度液体有机酸协同牛至香酚对嗜酸乳杆菌抑活作用

由表2 可知，液体有机酸作用1h 对大肠埃希氏菌活菌率具有很强抑制作用，稀释至750 倍未检出大肠埃希氏菌，稀释至1500 倍时，活菌率低至6.47%。即联合添加牛至香酚将极大抑制大肠埃希氏菌生长。

表2 不同浓度液体有机酸协同牛至香酚对大肠埃希氏菌抑活作用

由表3 可知，液体有机酸作用1h 对丁酸梭菌活菌率具有轻微抑制作用，活菌率与对照相比均在75%～86%，稀释至3000 倍活菌率与750 倍活菌率接近。液体有机酸作用1h 对金黄色葡萄球菌活菌率具有极强抑制作用，稀释至2250 倍均未有检出活菌；稀释至3000 倍活菌率也仅为1.57%；

表3 不同浓度液体有机酸对丁酸梭菌和金黄色葡萄球菌抑活作用

由表4 可知，与对照组相比，液体有机酸作用1h 凝结芽孢杆菌活菌率均高于对照组，具有一定促进凝结芽孢杆菌增殖效果，活菌率与对照相比均在1.57～1.85 倍，稀释至3000 倍活菌率与750 倍活菌率接近。液体有机酸对凝结芽孢杆菌作用2h，所有加酸组凝结芽孢杆菌活菌率均高于对照组，活菌率与对照相比均在1.37～2.06 倍。

表4 不同浓度液体有机酸对凝结芽孢杆菌抑活作用

3 讨论

本试验中，在水中添加液体有机酸作用1～2h 时，能促进凝结芽孢杆菌增殖，这是因为凝结芽孢杆菌具有显著的抗逆性，具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温高压、复活率高等特性，研究表明，凝结芽孢杆菌经口服进入胃后，在胃液酸性条件下会被活化，芽孢衣膨胀，水分增加，代谢加快（牛自康，2019；柯轲，2021），因此，一定的酸性环境能够促进其生长增殖。而本试验选择的液体有机酸对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抑制作用很大，在不添加牛至香酚情况下液体有机酸稀释750 倍时对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抑制率达95%以上，说明这两种畜禽常见病菌对酸的敏感性很高。

本试验研究还发现，液体有机酸作用1h 对丁酸梭菌活菌率具有轻微抑制作用，对嗜酸乳杆菌活菌率具有中等程度抑制作用，而协同牛至香酚强烈抑制嗜酸乳杆菌和大肠埃希氏菌增殖，说明不同的微生物对酸具有不同的耐受作用，而协同牛至香酚具有更好的抑菌效果，这可能是因为牛至香酚能够破坏细菌细胞膜的完整性，增加膜通透性，使细菌对酸性环境更为敏感（Basmacioglu-Malayoglu，2016）。

综合看来，单独添加液体有机酸（750 ～1500 倍稀释）有利于凝结芽孢杆菌增殖，对丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌影响较小，可强烈抑制金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌，因而更有利于酸制剂维持体内有益菌和有害菌之间的微生态平衡；联合添加牛至香酚，尽管进一步抑制了浓度本就极低的大肠埃希氏菌数，但严重抑制了嗜酸乳杆菌活菌数，因此可根据实际情况谨慎使用，其作用机理和对其他微生物的联合添加效应的影响关系还应进一步研究。