临床罕见曲霉菌属的研究进展

谢韵 帕丽达·阿布利孜

(新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830011)

曲霉病是由曲霉属真菌，如烟曲霉(85%)、黄曲霉(5%～10%)、土曲霉(2%～10%)和黑曲霉(2%～3%)引起的一组疾病。它可引起过敏性疾病，如过敏性鼻窦炎或过敏性支气管肺曲霉病，还可引起皮肤曲霉病、曲霉球、慢性肺曲霉病等临床疾病[1]。就患者结局和疾病管理而言，侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)是曲霉病最为严重的临床表现形式[2]。据报道，IA在极少数情况下会发生于免疫功能正常的患者[3-4]，主要见于恶性肿瘤或接受化疗、皮质类固醇和器官移植等免疫功能低下患者[5-6]。医学进步提高了免疫抑制条件下患者的生存率，但增加了IA的感染风险[7-8]。烟曲霉是曲霉病的主要病原真菌，但近二十年来，除烟曲霉外，其他曲霉属的分离率也越来越高。这一转变归因于免疫缺陷患者数量的增加、病原真菌检测和鉴定的进步以及广谱抗真菌药物的广泛使用。曲霉的鉴定通常是宏观和微观形态特征的判定[9]，这些方法难以将罕见曲霉菌种与其他相关菌种区分[10-11]。有一些罕见曲霉菌种如A.calidoustus和A.lentulus对多种抗真菌药物敏感性降低[12-13]。因此实验室需正确鉴定菌种、完善药敏试验结果以指导选择合适的抗真菌药。

1 流行情况

烟曲霉是临床上分离率最高的曲霉，黑曲霉、黄曲霉和土曲霉分离频率比烟曲霉低。以IA为对象的研究也表明，这4个菌种的分离频率较高[14]。Balajee等[15](以下简称TRANSNET研究)和Alastruey-Izquierdo等[16](以下简称FILPOP研究)，分别报告了200多个曲霉临床分离株的分析结果。在TRANSNET研究中，通过DNA序列鉴定，从美国移植受者中分离出208株曲霉，其中11%被鉴定为罕见曲霉菌属[15]。FILPOP研究显示，从深部组织、血液培养和呼吸器官中分离的323个菌株中，大约15%是Aspergilluslentulus、Aspergillustubingensis、Aspergilluscalidoustus、Aspergillusalliaceus等罕见菌种[16]。美国德克萨斯大学实验室分离了37株曲霉，对临床上相对少见的属部分进行初步鉴定。其中13个种为罕见菌种[17]。从韩国9所大学医院分离334株曲霉临床株，通过ITS区和D1/D2区序列测定[18]，仅β-微管蛋白测序就可鉴定出77株(23.1%)罕见曲霉临床分离株。这些菌种真实流行率尚不清楚，需要进一步扩大人群数量。过去几十年，因为鉴别水平有限且分子检测尙不能作为常规检测方法，造成实验室中的分离株被错误鉴定。罕见曲霉病的发生率往往比实际数据要高得多。

2 罕见曲霉的发现

罕见曲霉的故事始于A.lentulus[19]。Balajee及其同事调查了7株非典型烟曲霉临床分离株，它们产孢速度缓慢，对几种抗真菌药物的体外敏感性较低。通过多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)，发现其中4个菌株属于一个新的真菌种，命名为A.lentulus[19]。2013年的一则文献[19]报告了1例肾移植患者在移植4个月后感染肺炎，接受伏立康唑治疗后痊愈(MIC为0.5 μg/mL)，并从他的痰液中收集到A.lentulus。文献还提到了另外5例A.lentulus[20]的病例，但抗真菌治疗的实验室数据和临床信息有限。A.lentulus发现后不久，烟曲霉属部分出现了一个新菌种Neosartoryapseudofischeri(N.pseudofischeri)[20]。根据“一种真菌，一个名字”的倡议，现在被称为A.theromutatus[1]。实际上Balajee等[21]通过研究3株产孢量较差的烟曲霉分离株寻找A.lentulus。但在其中2例患有囊性纤维化患者的痰液中分离出A.theromutatus。自1929年以来，只有7例IA与A.theromutatus有关，其中3例没有抗真菌治疗的信息[21]。随着A.lentulus和A.theromutatus的出现，罕见曲霉属菌种呈指数增加。

3 曲霉的鉴定

重症监护室IA患者的死亡率可高达90%，但如果诊断及时，IA的总死亡率可下降至50%[22]。真菌培养是菌种诊断的“黄金标准”。但其根据形态诊断的敏感度和特异度有限，仅凭组织病理学很难做出物种水平的鉴定[23]。此外，真菌培养的生长周期较长，需要几天到几周的时间。这可能导致抗真菌治疗的延迟和选择不适合的药物。曲霉临床分离株在形态上有时容易混淆且专业性强，错误鉴定菌种的情况时常发生[9]。因此，迫切需要开发快速、无创和准确的鉴定技术，从形态、生长温度、药物敏感性和分子表型等几个方面[24]进行菌种鉴定。

3.1 DNA测序

rDNA内部转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)的序列分析是真菌中最常见的测序标记，一直被认为真菌的官方DNA条形码[25]，所涉及的引物几乎可以与任何真菌DNA杂交。国际人与动物真菌病协会为临床真菌鉴定，提供了一个ITS序列数据库[26]。但曲霉属的ITS区域没有足够的多态性，需要一个二级识别标记鉴定给定的菌种。钙调蛋白、β-微管蛋白和肌动蛋白都是曲霉分类中的关键基因，与ITS结合可准确鉴定曲霉属[27]。该方法关于真菌测序的有限数据不到1%、数据库中的注释错误以及广泛用于扩增β-微管蛋白基因的引物对benA基因没有特异性，存在一定的局限性，进而导致不一致分类树的产生[28]。测序既昂贵又耗时，因此很少有临床实验室常规开展。

3.2 MLST

MLST依赖管家基因编码区内的单核苷酸多态性(SNP)，以确保给定菌种的每个分离株都得到正确的扩增[29]。一些进化限制有望限制这类必需基因的突变，但管家基因的核苷酸变化率预计足以区分不同的菌株。MLST的初步步骤是在侧翼非可变区的测试位点外设计引物，经PCR扩增和Sanger测序后，点突变分别确定单倍体或二倍体微生物序列类型(ST)或二倍体序列类型(DST)。该方法具有实用性，前提是序列具有足够的质量。在处理从培养中获得的纯菌落时，MLST没有技术上的限制。但Sanger测序直接从临床样本中进行基因分型，MLST分型对混合物的检出率很低，无法检测到20%～30%以下的少数等位基因[30]。

3.3 MALDI-TOF MS质谱鉴定

物种水平鉴定需要对ITS序列以及β-微管蛋白或钙调蛋白基因进行核酸扩增和测序分析，大多数实验室不具备以上条件[31]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在快速准确地区分烟曲霉和其他曲霉方面结果可观[32]。MALDI-TOF MS能获得高精度的丝状真菌鉴定结果，这在以前仅限于少数几个参考实验室。Alanio等[33]描述了MALDI-TOF MS对罕见曲霉的鉴定，开发了一个参考光谱数据库，包括来自7个曲霉切片的28个临床相关菌种，其中有5个常见菌种和23个新菌种。同时，Normand等[34]描述了一种标准化的方法识别任一类型的丝状真菌，通过增加参考谱库中的参考文献数量，成功地解决了从混合丝状真菌培养物中获得异质MALDI-TOF光谱的关键问题。该步骤显著提高了MALDI-TOF MS鉴定临床丝状真菌的有效性。经过对大量丝状真菌分类群的进一步研究，验证了标准化的MALDI-TOF MS程序在物种水平上准确识别临床相关曲霉的能力，包括罕见曲霉菌种[35-37]。临床实验室的MALDI-TOF MS网络代表了该领域最近的重大发展。这一进展对于没有配备MALDI-TOF MS系统的实验室特别有用。这类实验室可以准备MALDI-TOF MS靶板，并将其发送到MALDI-TOF鉴定平台，之后通过专用软件接收结果[38]。鉴定质量直接取决于所用数据库的范围。Bruker的第一个商业模型数据库是丝状真菌库1.0[39]，一些作者[16，35]曾试图使用这个商业数据库来鉴定曲霉属，但由于引进的种和菌株数量较少，结果并不令人满意。西班牙的学者，花了两年的时间，为丝状真菌库1.0补充了一个内部参考数据库(HUVr)，并通过对固体培养基上生长的曲霉临床分离株进行鉴定来验证有效性[40]。研究结果显示：HUVr数据库增加了23个菌种的53个条目，可以收录12个新型罕见菌种，并增加已经收录的11个菌种的条目数量。而丝状真菌库1.0只提供了7个罕见菌种，分别占每个文库所含菌种总数的69.6%和38.9%。最后，补充的文库有142个条目，可以从11个部分鉴定出30种不同的曲霉：11个非罕见种和19个罕见种。通过前瞻性研究表明，无论介质类型(即固体或液体)，MALDI-TOF MS中HUVr数据库的使用具有较高的可靠性。95.5%的菌株在种水平上进行了鉴定，其余4.5%的菌株在属水平上进行了鉴定。如果Schulthess等[41]在没有增加错误识别的情况下进行标准评分，物种水平上的鉴定就会达到100%。法国作者通过一个独立的、可自由访问的在线质谱数据库，前瞻性地评估不同实验室中罕见曲霉菌种的鉴定准确性。鉴定结果与序列鉴定结果进行对比：在物种水平上，罕见曲霉菌种的整体准确率为66.1%，非罕见菌种的准确率为92.2%[42]。在MALDI-TOF MS中创建数据库是一个缓慢而昂贵的过程，但如果想要获得更好的鉴别能力，就有必要这样做。以上学者的研究，提高了实验室曲霉菌种的鉴定水平。这些研究成果可作为真菌实验室的常规丝状真菌鉴定，以提高临床相关曲霉菌种鉴定的准确性，并显著缩短反应时间。然而，这种技术价格昂贵，不能广泛使用，而且需要训练有素的人员才能操作。

4 药敏情况

就目前曲霉病管理指南所述，伏立康唑(VCZ)被推荐为IA的一线用药，两性霉素B(AMB)或异伍康唑(ISA)用于替代治疗。近年来唑类耐药菌株数量逐渐增加，其临床治疗效果并不理想。Pinto等[43]对190个烟曲霉分离株进行耐药观察，氮唑类对烟曲霉的MIC较高。AMB对黄曲霉和土曲霉有较高的MIC，81%的黄曲霉MIC≥2 mg/L[44]。而伊曲康唑(ITZ)对黑曲霉有较高的MIC(4 mg/L)，对AMB未显示出抗药性，这在以前的文献中也有描述[45]。

随着分子技术的革新，许多新的罕见曲霉被发现。如前文所述，其流行率为10%～15%，对唑类和AMB的敏感性很低[46]。但罕见曲霉的各研究数据存在异质性或不完整性，应该谨慎评估其抗真菌敏感性表型。有文献指出[23,47]，A.lentulus对唑类、AMB和棘球菌素类药物的敏感性降低；A.tubingensis对ITZ的抗药性比黑曲霉高，但与其他唑类化合物的交叉抗药性或对其他抗真菌药物的抗药性似乎很少见；A.Calidoustus对阿尼芬净、米卡芬净、AMB和特比萘芬的敏感度较低，但VCZ的MIC往往较高，而A.Ustus处于较低水平；AMB和卡泊芬净对A.alliaceus有较高的MIC，而VCZ和ITZ对该菌种的MIC通常较低。因此，正确鉴定临床分离株是使用最佳抗真菌药物的关键。

5 总 结

临床罕见曲霉菌属报告的增加和特殊人群(如危重患者)IA感染的报道，让医生们认识到种水平上准确鉴定真菌的必要性。MLST和MALDI-TOF MS提供了准确鉴定常见和罕见曲霉的方法。其中一些未知的曲霉对抗真菌药物有特殊的耐药性，识别错误会导致治疗不佳和预后不良。它们表现出很高(高达40%)的抗真菌耐药性，其标准化管理有特殊的临床意义。常见曲霉感染与罕见曲霉感染，两者治疗结果是否有差别，有待临床进一步验证。但罕见曲霉较高的抗真菌耐药性和死亡率频繁被报道[32,47,48]，有必要对临床分离的真菌进行正确的菌种鉴定和药敏试验。形态学的鉴定大多仅限于物种复合水平，新的鉴定技术将会更好更规范的进入到常规临床实验室。现今关于罕见曲霉治疗的临床数据非常有限，在治疗上是一个挑战，但也不要过度恐慌，早预防、早诊断结合体外药敏试验和分子技术，可更科学地治疗，提高患者生存率。