瘤组织中O-岩藻糖基转移酶1 基因表达变化对相关肿瘤预后的影响及其作用机制

于帆，韦唯，楼爽，何海洪，周义文

南方医科大学深圳医院临床检验医学中心，广东深圳 518000

肿瘤的增殖发育进程与多种基因表达相关［1］。对于在分子生物学研究中发现的与特定肿瘤相关的基因，进行基于大数据多组学的泛癌分析，对该基因在多种肿瘤组织中的表达情况、涉及信号通路及其相关的作用机制等方面进行探索与对比，可以对该基因与肿瘤的关系及其潜在临床意义进行更为全面的评估，并确定进一步研究的方向。当前，包括TCGA 数据库、GTEx 数据库在内的多个数据库包含了大量癌症相关测序数据，已被广泛用于对人体肿瘤基因表达情况的分析研究。

在之前基于RNA-Seq 的转录组学分析中发现，蛋白O-岩藻糖基转移酶1 基因（POFUT1）在结直肠癌组织中的表达水平高于正常组织，是结直肠癌的一个差异表达基因，近年多个研究也将POFUT1 报道为人类结直肠癌的关键基因［2-3］。有研究报道，POFUT1 基因的表达水平可以作为浸润性膀胱癌预后分析的一项独立指标［4］。WAN 等［5］研究则指出，POFUT1 的高水平表达可导致乳腺癌患者相对更差的预后。上述研究均提到，POFUT1 基因的突变及拷贝数变化对其在肿瘤发生中的作用具有重要意义。尽管POFUT1 已被发现在多种肿瘤组织中有不同程度的高水平表达，但其在不同类型肿瘤中的具体作用及机制仍然缺乏明确定论。目前尚无POFUT1与多种肿瘤相关性的分析。本研究中，我们基于多个现有的癌症数据库，首次对POFUT1 进行了泛癌分析，从而尝试观察其在多种肿瘤组织中的表达水平，分析不同POFUT1 水平肿瘤患者的预后及POFUT1 和其关联基因的生物学功能，以探索POFUT1对肿瘤预后的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据及其来源 本研究中所使用的泛癌数据集（TCGA Pan-Cancer）来自 TCGA 数据库（https：//portal. gdc. cancer. gov/），经 由 UCSC 数 据 库（https：//xenabrowser. net/）下载。由于 TCGA 数据库少量肿瘤类型无相应正常组织数据，我们将GEPIA2 工具中已整合的 GTEx 数据库（https：//www.gtexportal.org/）的部分数据纳入研究范围。

1.2 POFUT1 在不同类型相关肿瘤组织及其配对正常组织中的表达情况分析 利用在线分析工具TIMER2 及 TCGA 数据库泛癌数据集，对 POFUT1 在不同类型肿瘤组织及其配对的正常组织中的基因表达情况进行分析，同时运用GEPIA2 分析工具整合的GTEx 数据库中可用的相关正常组织数据对上述分析进行补充。上述流程均采用工具内置默认参数。此外我们利用GEPIA2 对POFUT1 在各类型肿瘤不同分期的基因表达情况进行了分析。

1.3 不同POFUT1 表达水平的相关肿瘤患者预后分析 利用 GEPIA2 的 Survival Map 模块对 TCGA 数据库中所有类型肿瘤的POFUT1 表达情况进行了包括总生存期及无病生存期在内的生存分析。依据POFUT1 在相应肿瘤组织中的表达量高低，将cutoff值设置为50%（即表达值中位数），将同种类型肿瘤样本分为POFUT1 高表达组与POFUT1 低表达组，并筛选出具有统计学差异的肿瘤类型。利用Survival Analysis模块进一步得到了POFUT1高低表达组生存期具有统计学差异的肿瘤类型的生存分析曲线。

1.4 POFUT1 与肿瘤免疫细胞浸润水平的关系分析 首先从TIMER 数据库获取纳入本研究的各类肿瘤组织中 B 淋巴细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞的浸润水平数据，并通过“Gene”模块分析POFUT1 表达水平与各肿瘤组织中上述6种免疫浸润细胞百分化的相关性（以P＜0.05为有统计学意义），并进一步根据P 值大小筛选其中具有高度相关性的肿瘤类型。

接下来对于前述筛选的肿瘤类型，首先通过R软件的Estimate 软件包分析，得到各类型肿瘤的Stromal Score（基质评分），Immune Score（免疫细胞浸润评分）和Estimate Score（综合评分），分别反映肿瘤组织的基质纯度、免疫细胞纯度和免疫细胞浸润程度；进一步使用R 软件的corr. test 函数分析所筛选肿瘤组织POFUT1 表达水平与免疫细胞浸润水平的相关性。

1.5 POFUT1 关联基因筛选及其信号通路分析首先利用String 数据库构建蛋白质互作网络（PPI 网络）对POFUT1 基因的关联基因进行筛选，所设置的筛选条件分别为minimum required interaction score（最小互作分数）= 0.150，meaning of network edges（互作网络节点意义）=evidence，检索范围仅限于经实验验证的互作蛋白编码基因（active interaction source = experiment），且仅展示 50 个最为相关的基因。经上述筛选可得到50 个与POFUT1 在结构功能上相关联的蛋白质编码基因，并得到相应的PPI网络图。

同时，在 GEPIA2 的 Similar Gene Detection 模块中进行检索，得到在TCGA 数据库所有肿瘤病例中与POFUT1 高度相关的100 个基因。我们尝试将这100 个基因与之前得到的50 个相关基因进行比对。随后将这两个基因集整合，利用DAVID 数据库对POFUT1及其关联基因作功能富集分析。

2 结果

2.1 不同相关肿瘤组织中POFUT1 表达水平 结合TIMER2 和GEPIA2 对各类肿瘤组织中POFUT1表达水平的分析结果显示，与配对的正常组织比较，POFUT1 在胆管癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、脑低级别胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、直肠腺癌、皮肤黑色素瘤、胃癌、胃食管癌、甲状腺癌的肿瘤组织中POFUT1 表达差异有统计学意义（P 均＜0.05）；在TIMER2 和GEPIA 数据库中同时均POFUT1 表达差异的肿瘤类型有7 种，分别为结肠癌、食管癌、胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、直肠腺癌、胃癌。

进一步利用GEPIA 对POFUT1在各类肿瘤不同临床分期患者中的表达量进行了对比，结果显示在可检索到的不同临床分期的9 种肿瘤患者中POFUT1表达量差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 POFUT1 高表达及低表达的相关肿瘤患者预后分析结果 POFUT1 高、低表达的肾透明细胞癌、脑低级别胶质瘤、间皮瘤、直肠腺癌、葡萄膜黑色素瘤患者总生存期比较，P＜0.05。其中肾透明细胞癌和直肠腺癌中，POFUT1 高表达组的总生存期高于POFUT1 低表达组（P＜0.05）；脑低级别胶质瘤、间皮瘤、葡萄膜黑色素瘤中，POFUT1 低表达组总生存期高于POFUT1 高表达组（P＜0.05）。此外，肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、脑低级别胶质瘤、间皮瘤、葡萄膜黑色素瘤中，POFUT1 低表达组的无病生存期均长于POFUT1高表达组（P＜0.05）。

2.3 POFUT1 与免疫细胞浸润水平的关系 在脑低级别胶质瘤、结肠癌及膀胱尿路上皮癌组织中的POFUT1 表达水平与纳入分析的6 类免疫细胞浸润水平（B 淋巴细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞百分比）具有最强的关联性。其中脑低级别胶质瘤组织中浸润的B淋巴细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞百分比与POFUT1 表达水平正相关（r 分 别 为 0.312、0.340、0.253、0.374、0.289、0.358，P 均＜0.05）；膀胱尿路上皮癌组织中浸润的CD8+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞百分比与POFUT1 表达水平正相关，r 分别为0.296、0.301、0.254、0.245，P 均＜0.05；POFUT1 表达水平与结肠癌组织中CD4+T 细胞、巨噬细胞呈正相关（r 分别为 0.257、0.134，P 均＜0.05），但与 CD8+T 细胞、中性粒细胞及树突状细胞呈负相关（r 分别为-0.182、-0.126、-0.106，P均＜0.05）。

POFUT1 表达水平与脑低级别胶质瘤、结肠癌、膀胱尿路上皮癌组织中的基质、免疫细胞浸润及综合评分的关联性分析结果显示，POFUT1 表达水平与脑低级别胶质瘤组织的基质、免疫细胞浸润及综合评分和结直肠癌组织的免疫细胞浸润评分均具有相关性（P均＜0.05）。

2.4 POFUT1 调控的信号通路 String 数据库中，得到50 个与POFUT1 在结构功能上相关联的蛋白质编码基因，并得到由上述基因编码蛋白构成的PPI 网络。同时，通过GEPIA2 的Similar Gene Detection 模块得到在TCGA 数据库所有肿瘤病例中与POFUT1 高度相关的100 个基因。对其中关联性最高的 5 个基因（TM9SF4、PLAGL2、KIF3B、MOCS3、STAU1）进一步分析，发现其表达与数据库中可检索的所有类型肿瘤均有显著相关性。将这100 个基因与之前得到的50个相关基因进行比对，但未发现重合基因。POFUT1 及其关联基因富集的通路主要为蛋白质结合及RNA 结合途径、丝氨酸相关酶途径、细胞凋亡通路和Notch信号通路。

3 讨论

基因调控肿瘤的生成发育过程已经成为当前的共识。探究特定的基因在不同类型肿瘤组织的中表达情况，有助于了解该基因在肿瘤发生过程中的作用机制，从而认识该基因在肿瘤诊断及治疗中的潜在价值。我们在对结直肠癌样本的转录组学分析中发现，POFUT1 可能是该类肿瘤的差异表达基因之一，其通过参与抑制细胞凋亡、促进血管形成及参与Notch信号通路等机制对结直肠肿瘤发生产生影响。同时，近几年的研究［5-7］也显示，POFUT1 在消化道肿瘤、乳腺癌、口腔癌等多种肿瘤发生发育过程中均表现出表达水平的差异，而其具体作用机制、调控效应尚无明确定论。鉴于POFUT1 的表达差异体现于多种肿瘤组织，且基于我们在TIMER 和GEPIA 数据库的分析，POFUT1 在绝大部分肿瘤组织中均呈现为显著高水平表达，因而我们可以推测POFUT1 作为一个潜在的致癌基因，在不同类型的肿瘤中参与相同的信号通路或具有相同的致病机制，从而促进肿瘤发生发展。而后续分析显示POFUT1 的表达量与肿瘤分期未体现明显关联，可能说明该基因在早期就已介入了肿瘤发生的调控。

对于POFUT1 表达水平对肿瘤患者生存的影响，我们所得到的结果表明在大多数类型肿瘤中，POFUT1 的高水平表达往往意味着患者更低的生存率，包括更短的总生存期和无病生存期。这提示POFUT1 可能在肿瘤发生发展的进程中起到了推进作用。事实上，2017 年已有研究得到了相似的结论［5］。关于引起较差预后的机制，有研究［8］表明，POFUT1在结直肠癌组织中与PLAG2具有双向促进作用，并通过Notch信号通路和Wnt信号通路参与影响肿瘤发生的过程。DU等［9］研究则发现POFUT1基因的沉默突变抑制了Notch 通路，从而抑制了肿瘤细胞的增殖发育，同样表明该基因对肿瘤发育的正向促进作用。POFUT1 是Notch 信号通路的重要组分之一，因而其高活性可导致Notch 信号通路的失调，而Notch 信号通路正是POFUT1促进肿瘤发育的关键途径之一［10］。

免疫浸润分析可以反映肿瘤组织与机体微环境的互相作用及影响［11］。对POFUT1 的免疫浸润分析结果表明，在膀胱尿路上皮癌，结肠癌和脑低级别胶质瘤组织中，POFUT1 表达水平与各类免疫细胞浸润程度呈现高度关联性，其中结肠癌组织中的CD8+T 细胞及树突状细胞浸润程度与POFUT1 表达水平呈显著负相关；膀胱尿路上皮癌与脑低级别胶质瘤的CD8+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞浸润程度均与POFUT1 表达水平呈正相关。上述结果提示POFUT1 表达水平的升高可能与肿瘤组织的异质性及不同类型的免疫细胞浸润强度有关。免疫细胞浸润已被证明可以影响肿瘤的发生和复发，并对肿瘤的免疫治疗和临床效果具有重要的作用［12］。有研究［13］表明，脑胶质瘤中的 CD4+T 细胞能够识别癌抗原，而被激活的M1 巨噬细胞可以抑制肿瘤生长。另有文献［14］表明，膀胱尿路上皮癌组织中CD4+T 细胞、CD8+T 细胞的高表达与更长的生存期相关。实验［15］证实较低的CD8+T 细胞浸润程度抑制了结肠癌细胞的凋亡，是促进病程发展的因素之一。我们的分析指出POFUT1 在多种肿瘤组织中的高水平表达和巨噬细胞的高水平浸润具有高度相关性，而肿瘤组织相关巨噬细胞已被证明具有促肿瘤发生作用［16］。

我们对POFUT1 及其相关联的基因进行了PPI网络的构建，并对参与PPI 网络的基因以及数据库检索的关联度较高的基因进行了功能富集分析，结果显示这些POFUT1 相关基因主要富集于蛋白质结合及RNA 结合途径、丝氨酸相关酶途径、细胞凋亡通路和Notch 信号通路。肿瘤细胞的增殖发育依赖于多种基因产物的调控，POFUT1 及其关联基因参与体内蛋白质及RNA 结合过程，该过程与肿瘤细胞mRNA 稳定性紧密相关。由蛋白质与RNA 结合功能紊乱引起的可变剪接紊乱是其肿瘤细胞mRNA 的重要特性之一［17］。同时在肿瘤进程中常见的3’-UTR 缩短的mRNA 异构体也是由该过程失调引起，而此类异构体将减少肿瘤负调控因子的结合位点，进而导致肿瘤增殖相关基因表达量升高，从而导致肿瘤的发生发展［18］。丝氨酸是癌细胞重要代谢物质之一，因此POFUT1 参与的丝氨酸相关酶途径与肿瘤细胞代谢相关。上世纪80 年代的研究已证实，丝氨酸在癌细胞中的合成呈增加趋势。丝氨酸生物合成途径的第一分支酶是磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）。目前发现包括乳腺癌及黑色素瘤中的PHGDH 表达均显著增高。此外，还有研究［19］证实，沉默PHGDH 可以显著影响部分依赖该酶的肿瘤生长。POFUT1 参与丝氨酸代谢的调控，进而影响肿瘤发生进程，我们认为其具有作为肿瘤调控靶点的潜力。Notch 信号通路是广泛参与肿瘤调控的经典信号通路之一，已被证实是POFUT1 致 癌 机 制 中 重 要 的 途 径［9，20］。 POFUT1 是Notch 通路的重要组分之一，参与调控EGF 样结构域的构成，其在实验中所展现的促进细胞分化、抑制细胞凋亡甚至是促血管生成等作用几乎均通过Notch 信号通路达成。Notch 通路目前被发现参与多种肿瘤发育进程，包括结直肠癌、乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、肾细胞癌、肺癌、神经胶质瘤等［21］。实际上，我们发现Notch 通路参与的肿瘤类型与POFUT1 高表达的肿瘤类型有较多重合。上述研究结果充分表明POFUT1 作为一个与多种肿瘤广泛相关的致癌基因，其自身或其关联基因具有作为肿瘤监测或治疗靶点的潜力。

总之，基于多数据库多组学的分析模式，我们对POFUT1 在多种类型肿瘤组织中的表达水平、遗传变异特征及潜在致病机制等方面进行了分析，并发现其在17种肿瘤组织中存在表达差异，且多表现为显著上调；高水平的POFUT1 表达通常导致更差的生存预期；POFUT1 与免疫浸润水平存在的关联也影响着肿瘤发展进程；POFUT1 及其相关基因广泛参与多种与肿瘤发育相关的功能通路。提示POFUT1 或其关联基因具有成为肿瘤检测或治疗靶点的潜在价值。由于本研究主要基于大数据生物信息学分析，部分分析结果及相关临床价值尚需进一步分子生物学实验验证。