初次接受恩替卡韦治疗的CHB患者血清HBV pgRNA、HBcrAg 水平动态观察

赵敏，张诗琬，冉紫晶，叶青，梅小平

川北医学院附属医院感染科，四川南充637000

目前，核苷（酸）类似物（NAs）的抗HBV 治疗是CHB 患者治疗的主要手段［1］，通过抑制 HBV DNA 逆转录来降低CHB 患者血清HBV DNA 载量以促进肝功能恢复与降低传染性，但抗HBV 治疗对肝细胞核内HBV 共价闭合环状DNA（cccDNA）没有明确清除作用［2］，其HBV 复制的动始环节是以肝细胞核内cccDNA 为模板进行 HBV pgRNA 逆转录，是 HBV 在CHB 患者体内持续复制和NAs 治疗停药后复发的主要原因。目前评价抗HBV 疗效及停药时机选择的生物学标志物有血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg等，但不能直接反映 HBV cccDNA 水平。研究［3-4］发现，CHB 患者血清中的乙型肝炎病毒前基因组RNA（HBV pgRNA）和松弛环状DNA（rcDNA）一样，存在于成熟病毒颗粒的核衣壳内，HBV pgRNA 是ccc DNA的直接产物，能反映肝内ccc DNA活性，阻断逆转录不影响HBV pgRNA 合成，作为能够反映HBV cccDNA水平的新型血清学标志物已受到重视，在评价抗HBV 疗效、病情程度等方面可能具有潜在临床价值。研究发现，HBV pgRNA 的状态可以反映慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗的长期预后。HB-crAg 由 HBV 前 C/C 区 编 码 的 HBcAg、HBeAg 与P22cr3 种蛋白质组成，其中P22cr 是 HBeAg 形成前的中间产物，有相同的149 个氨基酸序列［5］。CHEN等［6］研究发现 CHB 患者外周血 HBcrAg 水平较血清HBsAg 或HBV DNA 水平与肝细胞内HBV cccDNA水平的正相关性更强。研究结果提示，CHB 患者血清HBcrAg 水平可反映HBV 感染的自然病程，其动态变化可预测HBeAg 自发血清学转化［7-8］。在2018年欧洲肝病学会《慢性乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南》及我国2019 版《慢性乙型肝炎防治指南》［9］中均增加了 HBV 检测的 3 种新型生物学标志物，特别是血清HBV pgRNA 与HBcrAg 的检测给予了高度关注，但并未推荐临床应用，可能与HBV pgRNA 研究数据少、其血清中水平低及尚未形成统一检测标准等因素相关。本研究观察了恩替卡韦治疗的 CHB 患者血清 HBV pgRNA、HBcrAg 的动态水平表达变化，并分析了血清HBV pgRNA、HBcrAg 与CHB 患者病情之间的关系，血清HBV pgRNA、HB-crAg 与HBV DNA、HBsAg、HBeAg 之间的相关性，为血清HBV pgRNA、HBcrAg 检测在抗病毒药物治疗效果评估及停药时机选择中的应用提供更多研究数据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2020年6月—2021年10月在川北医学院附属医院感染科门诊或住院部就诊的初次使用恩替卡韦抗HBV 治疗并随访48 周的CHB 患者 105 例，男 60 例、女 45 例，年龄 34～72 岁。其中CHB 轻度 40 例、CHB 中度 35 例、CHB 重度 30 例，HBeAg（ +）51 例、HBeAg（-）54 例。CHB 患者诊断参照2019 年版《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准执行［9］。纳入标准：诊断均符合2019年版“慢性乙型肝炎防治指南”诊断标准；知情同意；均在6 个月内未行免疫调节与抗HBV治疗。排除标准：合并其他嗜/非嗜肝病毒感染及其他原因所致肝组织炎症；合并其他疾病。本研究经川北医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 血清HBV pgRNA 的检测 CHB 患者初次治疗前、治疗12 周、治疗24 周、治疗48 周时采集患者上午8：00时空腹静脉血标本3 mL，置于肝素抗凝管内，并在 6 h 内以 1 000 g/min 离心 15 min 后留取其上清液，置于-80 ℃冰箱保存。HBV pgRNA 水平采用PCR 定量检测试剂盒（湖南圣湘生物科技有限公司）。使用病毒RNA 提取试剂盒提取血清中的HBV RNA 粗品，再对提取到的HBV RNA 粗品进行纯化，然后再进行HBV RNA 反转录，最终检测出HBV pgRNA水平。

1.3 血清HBcrAg水平的检测 样本采集及保存同HBV pgRNA。将待测样本及标准品进行稀释，依次进行加样、温育、洗涤、加入酶标试剂、温育、洗涤、加入显色剂、加终止液，再测量各孔的吸光度（OD值），运用软件绘制标准曲线。根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的水平，再乘以稀释倍数计算出样品实际水平。

1.4 血清 HBV DNA、HBsAg、HBeAg 资料的收集从患者临床病例中收集CHB 患者治疗前、治疗12周、治疗24 周、治疗48 周时血清 HBV DNA、HBsAg、HBeAg等数据。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料以-x±s 表示，比较采用t 检验；多组间计量资料比较采用方差分析，进一步两两比较用LSD-t 检验。非正态计量资料采用M（IQR）表示，比较采用Kruskal-Wallis 检验。两指标间相关性分析采用Pearson检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB 患者治疗前后血清HBV pgRNA、HB-crAg、HBsAg、HBV DNA 水平变化 CHB 组患者在治 疗 第 0、12、24、48 周 时 HBV pgRNA 分 别 为（1.41 ± 0.13）、（1.33 ± 0.18）、（1.31 ± 0.94）、（1.27 ± 0.13）log10copies/mL，HBcrAg 分 别 为（2.34 ± 0.16）、（2.05 ± 0.32）、（1.98 ± 0.38）、（1.88 ± 0.57）log10 U/L，HBsAg 分 别 为（4.19 ±0.74）、（3.06 ± 0.40）、（2.47 ± 0.58）、（1.62 ±1.16）log10 IU/mL，HBV DNA 分 别 为 （6.89 ±0.96）、（4.19 ± 0.52）、（2.54 ± 0.49）、（1.35 ±0.20）log10copies/mL。 CHB 组患者在治疗第 12周、第24周、第48周时HBV pgRNA、HBcrAg、HBsAg及HBV DNA 水平较治疗前下降（P＜0.05）。CHB 患者血清 HBV pgRNA、HBcrAg、HBsAg、HBV DNA 分别在治疗各时段间比较，F 分别为12.278、23.799、120.501、675.802，P 均＜0.05，进一步各时间段间比较，P均＜0.05。

HBeAg（+）的CHB 患者中，治疗第0、12、24、48周时 HBV pgRNA 分别为（1.51 ± 0.06）、（1.38 ±0.07）、（1.34 ± 0.08）、（1.29 ± 0.08）log10copies/mL，HBcrAg 分 别 为（2.36 ± 0.18）、（2.14 ±0.40）、（1.99 ± 0.41）、（1.89 ± 0.44）log10 U/L，HBeAg（-）的 CHB 患者中，治疗第 0、12、24、48 周时HBV pgRNA 分别为（1.34 ± 0.13）、（1.29 ± 0.07）、（1.29 ± 0.09）、（1.25 ± 0.04）log10copies/mL，HB-crAg 分别为（2.33 ± 0.14）、（1.99 ± 0.27）、（1.97 ±0.19）、（1.87 ± 0.33）log10copies/mL，治疗前，与HBeAg（-）的 CHB 患者比较，HBeAg（+）的 CHB 患者HBV pgRNA、HBcrAg 水平高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，两组HBV pgRNA、HBcrAg 水平均下降（P＜0.05），以 HBeAg（ + ）CHB 组为著（P＜0.05）。

2.2 血清HBV pgRNA、HBcrAg 水平与 CHB 患者病情的关系 治疗前，CHB 轻度、中度、重度患者HBV pgRNA 分 别 为（1.43 ± 0.10）、（1.32 ± 0.16）、（1.20 ± 0.10 ）log10copies/mL，HBcrAg 分 别 为（2.41 ± 0.18）、（2.32 ± 0.29）、（2.19 ± 0.16）log10 U/L。随着病情程度加重，CHB 患者血清HBV pgRNA 及HBcrAg 水平下降（F 分别为 32.692、9.162，P 均＜0.05），CHB 轻度患者血清 HBV pgRNA 水平较 CHB中度及 CHB 重度患者高（P 均＜0.05）。血清 HBV pgRNA、HBcrAg水平与CHB患者病情程度呈负相关（r分别为-0.796、-0.670，P均＜0.05）。

2.3 CHB 患者血清 HBV pgRNA、HBcrAg 与 HBV DNA、HBsAg 水平间相关性分析 治疗前CHB 患者血 清 HBV pgRNA 水 平 与 HBcrAg、HBsAg 及 HBV DNA 水平呈正相关（r分别为0.620、0.729、0.720，P均＜0.05）；血清 HBcrAg 水平与 HBsAg 及 HBV DNA水平呈正相关（r 分别为 0.880、0.694，P 均＜0.05）。治疗后CHB 患者血清HBV pgRNA 水平与HBcrAg、HBsAg 及HBV DNA 水平呈正相关（r 分别为0.881、0.641、0.600，P 均＜0.05）；血清HBcrAg 水平与HB-sAg 及 HBV DNA 水平呈正相关（r 分别为 0.838、0.688，P均＜0.05）。

3 讨论

德国学者 KOCK［10］在 1996 年从 CHB 患者血清中首次检出HBV pgRNA后，即成为学者们的研究热点，有关HBV pgRNA 的报道也相继出现。TANAKA等［11］采用蔗糖梯度离心法检出了HBV pgRNA 等结构，确认了乙肝病毒颗粒中的核心成分是HBV pgRNA。在以HBV cccDNA 为模板转录出的HBV pgRNA 在逆转录过程中被降解，同时血清中HBV pgRNA 在NAs 等药物作用下对逆转录过程发生了抑制作用，CHB 患者血清HBV pgRNA 呈现出低水平表达。HBV复制的初始环节是以HBV cccDNA 为模板进行HBV pgRNA 逆转录，血清HBV pgRNA 是肝细胞中的pgRNA 在逆转录前直接获得包膜释放入血所致。HBV cccDNA 持续表达是HBV持续复制和复发的根源，目前的抗HBV 治疗尚不能完全清除CHB 患者肝细胞内HBV cccDNA，即使CHB 患者血清中HBV DNA、HBsAg 消失，肝细胞核中仍有不同水平的HBV cccDNA 表达，肝细胞核内只要有HBV cccDNA 表达就可致HBV 相关肝病患者病情复发与HBV 复制，这是HBV 相关性肝病患者疗程长，停药后易复发的关键因素，只有实现HBV cccDNA 零表达才是CHB 等肝病患者HBV 被彻底清除的核心目标［12］，但HBV cccDNA 仅在肝细胞内表达，需创伤性地通过活检肝组织来检测，另外，HBV cccDNA 在肝内表达呈不均匀分布，HBV rcDNA 在肝组织穿刺活检中对HBV cccDNA 的特异性产生影响，导致在临床中难以广泛地开展对HBV cccDNA 水平检测。需寻找新的血清标志物来间接地反映肝组织中HBV cccDNA 水平。研究［13］发现，肝细胞中 HBV pgRNA在逆转录之前可直接获得包膜进行包装后从肝细胞中释放入血而获得血清HBV pgRNA，即“HBV pgRNA 病毒样颗粒”。同时研究［14］发现，血清 HBV pgRNA 和和HBcrAg 水平检测对反映HBV cccDNA水平、评价抗HBV 疗效、选择停药时机、预测停药后疾病复发及HCC 发生风险等方面可能具有潜在临床价值。

目前临床上主要以HBV DNA、HBsAg 消失等作为判定CHB 患者病毒学应答情况、停药指征的指标，但仍有部分CHB 患者病情复发，表明CHB 患者肝脏中HBV cccDNA 并没有被清除或转录处于沉默状态。近年研究［14］发现，血清 HBV pgRNA 和HBcrAg 水平可反映HBV cccDNA 水平。在本研究中，CHB 组患者在治疗第 12、24、48 周时血清 HBV pgRNA、HBcrAg、HBsAg 及 HBV DNA 水平较治疗前下降，随时间的延长其下降速度趋缓，这与HBsAg、HBV DNA 下降趋势相同，说明血清HBV pgRNA、HBcrAg 可能可以作为评价抗病毒疗效的指标。本研究还发现，CHB 患者血清HBV pgRNA 水平、HBcrAg 水平与血清 HBV DNA、HBsAg 在治疗前初期和治疗后有明显相关性，进一步说明血清HBV pgRNA、HBcrAg 可能可预测抗病毒药物的病毒学应答情况。同时本试验还发现，HBeAg 的表达状况不同，循环血中HBV pgRNA 和HBcrAg水平也不相同。治疗前，与HBeAg（-）的CHB 患者比较，HBeAg（+）的 CHB 患者 HBV pgRNA 水平高，HBcrAg 水平也高，但差异无统计学意义。在治疗后，两组HBV pgRNA、HBcrAg 水平均呈下降趋势，HBeAg（ + ）CHB 组明显，与文献［15］报道结果一致。HBeAg（-）的CHB 患者常伴随HBV cccDNA 水平降低，提示HBV DNA 复制程度降低［16］。由此认为，在治疗过程中，肝细胞内HBV cccDNA 的转录活性下降，导致血清中HBV pgRNA 水平、HBcrAg 水平逐渐降低，提示血清HBV pgRNA 和HBcrAg水平变化将可能作为反映HBV cccDNA 水平、预测HBeAg 血清学转换等方面的重要参考指标。

本研究显示，随病情程度加重，CHB 患者外周血中HBV pgRNA、HBcrAg 水平逐渐下降，CHB 轻度组血清HBV pgRNA 水平较CHB 中度及CHB 重度组高；HBV pgRNA、HBcrAg 水平与CHB 病情程度呈负相关系，与鲁凤民等［17-18］研究结果相近。随着CHB患者病情进展，HBV DNA 水平低表达，可能原因是循环血中的游离HBV DNA 进入肝细胞核，并与肝细胞核整合；同时CHB 患者体内细胞免疫与体液免疫增强，对CHB 患者血清游离HBV DNA 的清除作用随病程延长及体内免疫功能增强而增强，从而导致血中游离HBV DNA 水平降低；另外，随着CHB 患者病情加重其循环血中HBsAg、HBeAg水平下调，机体内产生了针对HBsAg 的保护性抗体，激活后的免疫系统在清除HBV 的同时，HBV 复制能力与水平下调，HBsAg、HBeAg 水平也随之下降，其相应的HBV pgRNA 及HBcrAg 水平也出现明显下调。说明血清HBV pgRNA及HBcrAg水平可能可作为反映CHB患者病情的指标应用于临床。

在抗HBV 治疗过程中，患者血清HBV pgRNA水平、HBcrAg 水平随着治疗时间的延长呈下降趋势，随时间的延长其下降速度趋缓，这与HBsAg、HBV DNA 也呈下降趋势相同，且患者血清HBV pgRNA 水平、HBcrAg 水平与血清 HBV DNA、HBsAg在治疗前初期和治疗后有明显相关性，表明血清HBV pgRNA、HBcrAg 可能与HBsAg、HBV DNA 一样可预测抗HBV 疗效、进一步指导抗病毒药停药时间。

综上所述，CHB 患者血清HBV pgRNA、HBcrAg水平随恩替卡韦治疗疗程延长呈下降趋势，HBeAg（+）的CHB 患者下降更明显；血清HBV pgRNA、HBcrAg 水平与患者病情程度及HBsAg、HBV DNA水平有关。目前有关如何确定CHB 患者治疗终点及何时安全停药是一个极具争议的临床问题。寻找新的评价CHB 患者抗HBV 完全应答的血清学标志物以反映cccDNA 的存在及水平，为接受抗HBV 治疗选择治疗终点是一项艰巨性工作。HBV pgRNA、HBcrAg 或许可以成为CHB 抗HBV 药物的疗效评估及治疗终点选择的指标。