阿魏酸对人脐带血内皮祖细胞生物学功能及血小板衍生生长因子分泌能力的影响

胡婧蓉，陈姿霖，朱芙蓉，白雪，张熙，赵卓阳，何晶晶，熊武

1湖南中医药大学第一附属医院烧伤整形外科，长沙410007；2湖南中医药大学中西医结合学院；3湖南中医药大学第一附属医院内分泌科；4湖南中医药大学临床医学院病理学教研室；5湖南中医药大学中医学院

内皮祖细胞(EPCs)大多位于骨髓中，少数可以在外周血中发现，能够分化成为血管内皮细胞。内皮细胞可以通过迁移和增殖，从原先已有的血管以发芽的形式形成新的血管[1]。研究表明，EPCs的数量、功能及其活性与血管新生密切相关。血小板衍生生长因子(PDGF)是EPCs分泌的生长因子之一，能够刺激肉芽组织生成、促进血管新生、加快创面愈合及修复[2]。在血管新生功能不良及伤口不易愈合的糖尿病血管并发症中，EPCs对溃疡治疗和创面愈合有重要作用[3]。通过促进EPCs数量增加，改善其功能及活性，可以加强EPCs的血管新生作用，治疗糖尿病血管并发症引发的溃疡。阿魏酸(FA)是阿魏、当归、川芎等具有活血化瘀功效的中草药的主要活性成分，具有抑制血小板聚集、改善组织局部血供和促进血管新生的作用[4]。2020年9月—12月，我们将FA体外作用于EPCs，观察其对EPCs增殖、黏附、迁移和成管等生物学功能以及分泌PDGF的影响，旨在为FA调节EPCs介导的血管新生研究奠定基础，进一步为FA用于临床治疗糖尿病足溃疡等慢性难愈性创面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 无菌条件下取足月健康新生儿中的脐带血。本研究获得湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审核同意，脐带血的获取得到孕妇及其家属同意，并签署知情同意书。

1.1.2 药物与试剂 FA(中国北京索莱宝科技有限公司)，青霉素—链霉素双抗溶液(南京凯基生物科技发展有限公司)，胰酶(美国GIBCO公司)，PBS缓冲液(美国Hyclone公司)，DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国GIBCO公司)，淋巴细胞分离液(美国Solarbio公司)，纤维连接蛋白(美国Sigma公司)，FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-1，美国Sigma公司)，DAPI(美国Sigma公司)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(美国Thermo Fisher Scientific公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁公司)，PDGF ELISA检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。

1.1.3 仪器 台式低速离心机(上海知信实验仪器技术有限公司)，4 ℃离心机(德国Eppendorf公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，倒置生物显微镜(日本OLYMPUS公司)，荧光显微镜(北京同舟同德公司)，Thermo热电MK3酶标仪(美国BD Pharmingen公司)。

1.2 EPCs的分离、培养与鉴定 将脐带血抗凝静置后，加入淋巴细胞分离液，1 500 r/min离心30 min，获得单个核细胞。将单个核细胞加入PBS缓冲液，1 000 r/min离心5 min，此过程重复2遍。加入含5%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM/F12培养基，37 ℃培养24 h。取贴壁细胞，更换培养液继续培养24 h。连续培养7 d后，用胰酶消化贴壁细胞进行传代。经CD31抗体和DAPI核染、FITC-UEA-1和Dil-AC-LDL双荧光联合染色法鉴定得到EPCs。

1.3 FA促EPCs增殖最佳浓度的筛选 将获得的EPCs分别加入0、1、2、4、8、16 mg/L FA，培养48 h。采用CCK-8法检测细胞增殖情况，结果显示，0、1、2、4、8、16 mg/L FA作用后的细胞增殖OD值分别为0.50±0.04、0.71±0.02、0.78±0.08、0.90±0.04、0.92±0.07、0.92±0.03。以FA浓度为8 mg/L时细胞增殖能力最强，故将此浓度作为FA促EPCs增殖的最佳浓度。

1.4 EPCs增殖能力观察 收集对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，配制成100 μL的细胞悬液，按每孔1×105个细胞接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。将细胞分成FA组和对照组，FA组加入8 mg/L FA，对照组加入等体积PBS，置于培养箱中培养48 h。按每孔10 μL加入CCK-8溶液，孵育4 h。上酶标仪，于450 nm处测定光密度(OD)值，以OD值表示细胞增殖能力。

1.5 EPCs黏附能力观察 采用细胞黏附试验。收集对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，配制成500 μL的细胞悬液，按每孔1×105个细胞接种于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。将细胞分为FA组和对照组，分别加入8 mg/L FA和等体积PBS，置于培养箱中培养48 h。在包被有大鼠纤维连接蛋白的培养板上接种EPCs，37 ℃培养30 min。在倒置生物显微镜(200×)下计数贴壁细胞数目。

1.6 EPCs迁移能力观察 采用细胞划痕试验。用灭菌的Marker笔于6孔板背面划5条以上间隔1 cm横穿过孔的线。取对数生长期细胞，按每孔5×105个细胞接种于6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。第2天用无菌200 μL枪头在培养孔底部中央划线，与背后的横线划痕相垂直，用PBS洗掉划下的细胞。将细胞分为两组，FA组加入8 mg/L FA，对照组加入等体积PBS，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。在倒置生物显微镜(200×)下，利用显微标尺取不同的2个视野，在0、48 h分别测量划痕愈合状况，计算细胞迁移绝对宽度，以此表示细胞迁移能力。细胞迁移绝对宽度=0 h划痕的平均边距-48 h划痕的平均边距。

1.7 EPCs成管能力观察 采用Matrigel体外成管试验。用M200无血清及生长因子补充物的培养基1∶1稀释Matrigel基质胶，均匀混匀后，按每孔50 μL加入提前预冷的12孔板中，37 ℃孵育30 min。当细胞生长至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按每孔1×105个细胞接种于12孔板，每孔加入1 mL含10% FBS的DMEM/F12重悬，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，FA组加入8 mg/L FA，对照组加入等体积PBS，置于培养箱中培养48 h。在生物倒置显微镜下拍照观察，计数小管形成数量，取平均值。

1.8 EPCs分泌PDGF水平检测 采用ELISA法。收集对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，配制成100 μL的细胞悬液，按每孔1×105个细胞接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。将细胞分为两组，FA组加入8 mg/L FA，对照组加入等体积PBS，置于培养箱中培养48 h。分别取两组细胞上清液，严格按照PDGF ELISA检测试剂盒说明，上酶标仪测量450 nm处的OD值，计算PDGF含量。

2 结果

2.1 两组细胞增殖能力比较 FA组OD值为0.77±0.13，对照组为0.43±0.07，FA组OD值高于对照组(P<0.01)。

2.2 两组细胞黏附能力比较 FA组贴壁细胞数为(48.66±5.82)个，对照组为(31.32±2.90)个，FA组贴壁细胞数较对照组增加(P<0.01)。

2.3 两组细胞迁移能力比较 FA组细胞迁移绝对宽度为(13.13±0.25)mm，对照组为(10.77±0.76)mm，FA组细胞迁移绝对宽度较对照组增加(P<0.01)。

2.4 两组细胞成管能力比较 FA组体外成管数为(594.91±73.12)个，对照组为(271.64±31.02)个，FA组体外成管数高于对照组(P<0.01)。

2.5 两组PDGF水平比较 FA组PDGF水平为(249.97±14.23)pg/mL，对照组为(53.97±9.62)pg/mL，FA组PDGF水平高于对照组(P<0.01)。

3 讨论

FA又称4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，存在于阿魏、当归和川芎等多种中药中，是桂皮酸(肉桂酸)的衍生物，有顺式和反式两种结构。FA具有改善血液循环、促进血管生成、加速伤口愈合、抗氧化[5]、抗血栓[6]、降血脂、降低心肌缺血和耗氧量、抗菌[7]、抗病毒、抗癌等多种功效。BAIRAGI等[8]报道，在糖尿病大鼠创面中，用FA负载聚合物纳米粒子分散(口服)和FA负载聚合物纳米粒子(局部给药)治疗后，创面上皮化速度快，对创面愈合有明显的促进作用。在创面愈合过程中，血管新生具有关键作用，而内皮细胞增生是血管新生的开始。研究发现，FA能通过调节JAK-STAT通路促进血管内皮细胞增殖，从而促进血管新生，改善缺氧所造成的细胞形态改变[9]。SHAO等[10]报道，FA可通过血栓调节素通路显著缓解人脐静脉内皮细胞受到的辐射损伤，减轻4 Gy剂量辐射对内皮细胞增殖能力、细胞活力、管形成能力、细胞周期和炎症反应的影响。然而FA是否存在新的促血管新生途径，目前尚无文献报道。

EPCs的动员、招募和分化在促进血管新生、血管重构和早期抗炎过程中发挥重要作用。EPCs在上述过程中通过直接和间接两种途径发挥作用，直接途径为EPCs直接形成血管；间接途径依赖于EPCs分化成血管内皮细胞及其分泌的有关因子参与血管新生[11]，虽然经内皮祖细胞分化的内皮细胞不是构建体外血管化组织的标准内皮细胞[12]，但在血管新生过程中也有重要价值。在治疗缺血性疾病如缺血性心脏病和跛行方面，增加内皮祖细胞的数量和改善其功能已经成为治疗方法之一[13-14]。本研究结果显示，FA组细胞增殖能力高于对照组，表明FA能够明显加快EPCs增殖，促进毛细血管内皮细胞的再生；FA组贴壁细胞数较对照组增加，表明FA能够增强EPCs的黏附能力，使EPCs更好地黏附聚集于受损的血管组织，促进内皮修复；FA组细胞迁移绝对宽度较对照组增加，表明FA能够增强EPCs的迁移能力，促使其归巢于受损组织，加速缺血组织或创面的愈合；FA组体外成管数高于对照组，表明FA能够增强EPCs的成管能力，增加血管新生。FA通过促进EPCs的增殖、黏附、迁移及体外成管能力，促使局部组织再内皮化，增强血管形成能力，促进血管新生，具有促进创面愈合的潜能。

PDGF与血管内皮生长因子具有同源性，其在内皮细胞中高度表达，是促进血管生成的重要因子之一[15]。PDGF信号转导是细胞纤维化过程中的中枢介质[16]，成纤维细胞的数量随PDGF的增加而增加，大量成纤维细胞有助于胶原蛋白的合成[17]，能够促进血管新生。研究显示，PDGF家族中的PDGF-C和PDGF-D是治疗许多眼部新生血管疾病如增殖性玻璃体视网膜病变等重要靶分子[18]。本研究结果显示，FA组PDGF水平高于对照组，表明FA能够促进EPCs分泌PDGF，从而促进血管新生。

综上所述，FA能够在体外增强EPCs的生物学功能，并促进细胞分泌PDGF，具有加强EPCs介导的血管新生从而促进创面愈合的潜能。这表明FA对血管新生的促进作用不仅在于能正向调控血管内皮细胞的生物学功能，还能直接作用于EPCs，从根源上调控血管再内皮化进程，为后续深入研究FA通过EPCs介导的血管新生促进创面愈合的机制研究奠定了理论基础。