免疫调节剂在慢性乙型肝炎治疗中的应用进展

奉慧东，郑智武，陈宁

延边大学附属医院感染科，吉林延吉133000

乙型肝炎病毒(HBV)感染可导致一系列肝脏和肝炎并发症，慢性感染者中约有25%的患者最终发展为肝硬化和肝癌。干扰素α(IFN-α)和核苷(酸)类似物(NUCs)是目前治疗慢性乙型肝炎(CHB)的主要药物，通过抑制病毒复制可达到HBV的临床治愈。但NUCs停药后病毒复制易反弹，长期服药不仅增加患者的经济负担，还会导致耐药或肾毒性等严重不良反应；IFN-α可通过诱导干扰素刺激基因(ISG)直接抑制HBV DNA复制，但受到高成本、众多不良反应和低应答率的限制。HBV感染的免疫反应涉及先天性免疫应答和适应性免疫应答。研究显示，CHB的发展与先天性免疫应答障碍、HBV特异性免疫反应缺失有关[1]。对于CHB患者，免疫治疗的目标是以恢复有效的抗病毒免疫反应的方式来调控免疫系统。目前有多种免疫调节剂用于治疗CHB，包括维甲酸诱导基因1(RIG-1)激动剂、Toll样受体7(TLR-7)激动剂、免疫检查点抑制剂、治疗性疫苗等。现将免疫调节剂在慢性乙型肝炎治疗中的应用进展综述如下。

1 先天性免疫调节剂

先天免疫系统是宿主细胞抵御病毒感染的第一道防线。模式识别受体(PRR)在感受外源病原体后，能够快速诱导感染细胞分泌IFN，IFN诱导周围细胞表达ISG，保护肝细胞免受新生感染[2]。然而HBV具有能够避免先天性免疫识别的隐身特性，HBV感染并不能在黑猩猩体内诱导IFN/ISG反应，在急性HBV感染患者血清中几乎没有检测到细胞因子诱导[3]。因此，针对先天性免疫反应的分子在治疗CHB方面大有希望。

1.1 RIG-1激动剂 Inarigivir是一种口服HBV抗病毒药物，是激活RIG-1、病毒感受器蛋白和核苷酸结合寡聚域的多重激动剂，具有调节宿主固有免疫和直接抑制病毒复制的作用，通过激动RIG-1受体不仅能在HBV感染细胞中诱导IFN，还可以通过识别HBV pgRNA的5＇端ε结构来阻断HBV复制的能力[4]。

在长期感染土拨鼠肝炎病毒(WHV)的土拨鼠模型中，连续12周口服Inarigivir治疗有良好的耐受性，所有土拨鼠血清WHV DNA较治疗前降低，且高剂量组较低剂量组病毒载量降低更明显；肝脏WHV核酸和抗原水平降低，肝脏炎症减轻；停止给药后，病毒复发有剂量依赖性延迟。这表明除了直接的抗病毒活性外，Inarigivir还可通过激活病毒感受器途径在慢性肝炎病毒感染期间诱导抗病毒免疫[5]。

目前Inarigivir已经进行Ⅱ期临床试验，在未接受过治疗的CHB患者中，与安慰剂组相比，口服Inarigivir 25 mg/d和50 mg/d、持续12周的患者，HBV DNA总体下降0.7log10，HBV RNA总体下降1.4log10；且小剂量Inarigivir毒性反应轻，耐受性较好，未发生严重不良反应事件[6]。在另一项临床队列研究中，未接受过治疗的HBV患者口服Inarigivir 200 mg/d治疗12周后，HBV DNA最多下降了3.3 log10；HBV DNA和HBV RNA以剂量依赖的方式减少，尤其在HBeAg阴性患者中降低更明显[7]。该研究证实了Inarigivir在200 mg/d剂量下的安全性和抗病毒疗效。

1.2 TLR-7激动剂 TLR-7在B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞中表达，可激活B淋巴细胞转化为浆细胞，增强肝细胞中抗原加工和呈递，并在巨噬细胞和树突状细胞中诱导产生多种细胞因子和趋化因子，以激活感染时的防御反应。TLR-7激动剂包括GS-9620和JNJ-4964。

研究显示，GS-9620能够诱导肠道和肝脏中的浆细胞样树突状细胞产生IFN-α，增加T淋巴细胞和NK细胞的反应，同时降低NK细胞抑制T淋巴细胞的能力，但血清HBsAg水平下降并不明显[8]。体外细胞模型显示，GS-9620诱导的Ⅰ型IFN可以持续抑制人原代肝细胞和终末分化肝细胞中的HBV，增强HBV抗原呈递，但未减低核内共价闭环DNA(cccDNA)水平[9]。初步临床试验表明，GS-9620可以在没有血清IFN的情况下诱导泛素蛋白ISG15生成，并在低剂量时增强T淋巴细胞和NK细胞反应；但其HBV DNA抑制率并不高于替诺福韦单药，且在给药12周后未观察到患者HBsAg水平明显改善，因此GS-9620治疗宣告失败[10]。

JNJ-4964在恢复免疫应答中起重要作用。动物试验显示，JNJ-4964治疗AAV/HBV小鼠12周显示出强大而持久的抗HBV活性，开始治疗14 d后均检测不到HBV DNA和HBsAg，且无ALT升高，随访结束前未观察到HBV DNA和HBsAg反弹；从治疗后21 d到随访结束时可观察到HBsAg血清转换和HBsAg特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞反应，肝脏HBV DNA和HBV RNA水平分别下降了1.2 log10和0.5log10。该药目前处在临床开发阶段，已证实可以刺激健康志愿者和CHB患者的免疫应答反应[11-12]。

1.3 TLR-8激动剂 TLR-8主要在单核巨噬细胞和髓样树突状细胞中表达，在这些细胞中诱导激活以形成强大的Th1特征。TLR-8激动剂可诱导肝内单核细胞产生IL-12和IL-18，刺激肝内淋巴细胞产生大量IFN-c，激发肝脏的先天免疫反应[13]。

GS-9688是一种在临床开发中的TLR-8选择性小分子激动剂，在感染WHV的土拨鼠模型有限、短期的治疗中具有良好耐受性，治疗8周后及研究结束时，肝内WHV cccDNA、DNA和RNA下降了95%以上，并诱导持续对WHV DNA和肝炎表面抗原的抑制效应(治疗结束后>5个月)，降低肝内cccDNA水平[14]。已公布的Ⅰa期临床试验结果显示，口服GS-9688可诱导激活肝内细胞因子，以剂量依赖的方式激活NK细胞，并迅速上调其死亡配体TRAIL表达，具有良好的耐受性和药效活性。目前该药正继续开展Ⅱ期临床试验。

1.4 胸腺素α1(Tα1) Tα1通过髓样和浆细胞样树突状细胞上的TLR2和TLR9发挥作用，可诱导树突状细胞和T淋巴细胞的活化和分化，以及细胞因子INF-γ和IL-2的启动[15]。

在慢性WHV模型中，土拨鼠接受30周的Tα1治疗后，WHV水平显著下降，然而病毒载量在随访期间内恢复到了治疗前水平；继续观察更长一段时间后，治疗组肝细胞癌的发生率显著低于未治疗组[16]。在恩替卡韦联合Tα1治疗CHB的随机对照临床试验中，治疗结束后患者血清ALT、AST、TBIL均较治疗前明显下降，A/G高于治疗前，联合治疗组AST、ALT及A/G改善优于单用恩替卡韦治疗组，HBV-DNA、HBeAg转阴率高于单用恩替卡韦治疗组[17-18]。这表明恩替卡韦联合Tα1较单用恩替卡韦具有更高的抑制肝细胞癌发展的趋势。

2 适应性免疫调节剂

适应性免疫反应对控制HBV感染具有重要作用，其中HBV特异性T淋巴细胞反应对于终止HBV感染至关重要。在CHB患者中，HBV特异性T淋巴细胞反应功能过早衰竭或缺失，程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4、细胞免疫球蛋白黏蛋白3、T淋巴细胞免疫球蛋白等多种抑制受体上调，脂肪酸氧化受损，活性氧生产过剩，线粒体功能障碍和效应T淋巴细胞缺陷；上述反应阻碍了适应性免疫应答对HBV病毒的清除[19]。因此，以宿主免疫为靶点，降低免疫低应答及无应答是治疗CHB感染的重要手段。

2.1 免疫检查点抑制剂 PD-1/PD-L1在免疫耐受中具有关键作用，PD-1/PD-L1阻断剂能够增加HBV抗体的产生和HBV特异性T淋巴细胞的数量和功能，从而介导HBV感染细胞的清除。但在CHB感染期间，由于抑制性PD-1/PD-L1轴被上调，导致HBV特异性T淋巴细胞功能障碍[20]。

对感染WHV的土拨鼠模型采用PD-L1阻断剂联合恩替卡韦治疗后，病毒血症和抗原血症得到控制，其中部分动物在停止治疗后，这一效应仍保持不变，表明PD-L1阻断即使在停止治疗后仍可以产生持久的抗病毒效果,且治疗期间未发生严重不良反应[21]。体外实验显示，抗PD-1治疗不仅能够增加CHB患者抗HBs的B淋巴细胞数量，而且使B淋巴细胞成熟为分泌B淋巴细胞的能力增加了9.7倍。抗PD-1疗法不仅能够促进HBsAg特异性B淋巴细胞恢复，同时还能改善HBV特异性T淋巴细胞和特异性B淋巴细胞免疫应答。对HBeAg阴性的CHB患者给予PD-1抑制剂纳武利尤单抗，24周时HBsAg滴度平均降低了0.5log10，而且在1例患者中实现了HBsAg持续清除和血清转换[22]。FERRANDO-MARTINEZ等[23]认为，成功的抗病毒治疗并不能将PD-1/PD-L1轴恢复到正常水平，但对HBeAg阴性患者给予抗PD-L1单克隆抗体MEDI2790治疗后，可增加产生INF-γ的T淋巴细胞数量，还能使HBV特异性T淋巴细胞功能增强。以上研究表明，PD-1/PD-L1阻断剂可能是恢复慢性HBV感染患者HBV反应性T淋巴细胞和B淋巴细胞功能的最有希望的方法。

2.2 治疗性疫苗 治疗性疫苗可通过诱导动态免疫反应来改善患者的预后，是提高当前抗病毒治疗方案有效性的一种新方法。目前正在开发的治疗性候选疫苗种类包括基于蛋白质/肽、基于活载体、基于DNA和基于细胞的疫苗疗法[24]。

2.2.1 TG1050 TG1050是一种以腺病毒为基础的治疗性疫苗。在HBV感染小鼠模型中，TG1050可诱导肝内产生功能性T淋巴细胞，使其具有细胞毒作用并释放细胞因子，在11～15周的观察期结束后，HBV-DNA和HBsAg平均值分别下降了0.5log10和0.8log10[25]。在接受NUCs治疗的CHB患者中完成的一项Ⅰb期临床对照试验显示，TG1050诱导了HBV特异性细胞免疫应答，证实了TG1050的免疫原性以及其破坏CHB免疫耐受的能力[26]。目前该药已进入Ⅱ期临床试验阶段。

2.2.2 AIC649 AIC649是一种灭活的羊副痘病毒乙型肝炎疫苗，它能诱导自然的、自限性的免疫应答，从而增强患者自身针对病毒做出适当的免疫应答。首次应用于32例CHB患者的临床研究显示，AIC649单剂量静脉注射具有较好的安全性和耐受性，可增加血浆IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ水平，同时降低血浆IL-10水平。接受治疗的患者在抗HBe血清转化时出现了HBeAg损失，尽管HBsAg水平没有变化，但抗HBsAb呈阳性[27]。

2.2.3 GS-4774 GS-4774是含有HBV S蛋白、核心蛋白和X蛋白的治疗性疫苗。一项替诺福韦单独或联合使用GS-4774的Ⅱ期临床研究中，在治疗24周和48周时，联合用药的患者可观察到CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ、TNF、IL-2的量增加，而在替诺福韦单独治疗的患者中没有观察到此变化。T淋巴细胞功能增强与Treg细胞数量减少相关，然而GS-4774治疗最终并没有降低患者的HBsAg水平，仅能够刺激宿主CD8+T淋巴细胞反应，无法控制CHB进展[28]。

2.2.4 NASVAC 候选鼻用疫苗(NASVAC)中同时含有HBsAg和HBcAg重组蛋白。Ⅰ期临床试验结果表明，NASVAC在健康成年人中显示出较好的耐受性、安全性且具有免疫原性[29]。在一项随机对照的Ⅲ期临床试验中，160例CHB患者分别给予NASVAC和Peg-IFN治疗，在治疗结束时，两组HBV病毒载量低于检测下限的患者比例分别为62.5%、59.0%，组间比较差异无统计学意义；随访24周时，两组HBV载量低于检测下限的患者比例分别为57.7%、35.0%，NASVAC组高于Peg-IFN组。此外，与Peg-IFN相比，NASVAC更安全，并显示出较低的肝纤维化进展[30]。

2.3 凋亡蛋白抑制因子(IAPs)拮抗剂 IAPs是一类高度保守的内源性抗凋亡分子，通过BIR结构域直接干扰Caspases蛋白水解活性，保护细胞免于死亡，并参与多种病原体识别受体信号通路[31]。CHB患者肝内表达IAPs增多，导致HBV感染的肝细胞出现免疫逃逸，不能被特异性T淋巴细胞所识别或攻击，因此IAPs拮抗剂可以通过诱导HBV感染的肝细胞凋亡来特异性地消除细胞内cccDNA。

APG-1387是一种新型的以IAPs为靶点的SMAC模拟小分子抑制剂，可减少Treg分化、下调PD-1表达、诱导CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞分泌TNF-α和IFN-c，进而促进NK细胞增殖和增强T淋巴细胞功能。小剂量APG-1387可上调钙网蛋白和HLA-DR表达，进而激活树突状细胞，增加抗原提呈；高剂量APG-1387可使体外培养的外周血单个核细胞中的NK细胞数量增加2倍以上[32]。鉴于APG-1387对免疫细胞的增强作用，以及APG-1387的低毒作用，将其与现有的免疫治疗相结合是提高CHB免疫治疗效果的可行途径。目前该药正在进行Ⅰ期临床研究。

2.4 重定向T淋巴细胞 重定向T淋巴细胞是治疗慢性HBV感染和HBV相关性肝癌的有效手段，可以提高T淋巴细胞受体对特定抗原的亲和力。无论是T淋巴细胞工程表达HBV特异性T淋巴细胞受体(TCR)还是嵌合抗原受体(CAR)，都可以补充慢性HBV患者缺失或功能耗竭的HBV特异性T淋巴细胞。

研究显示，从HBV慢性感染患者的淋巴细胞中获得的表达HBV特异性受体的T淋巴细胞能够产生抗病毒细胞因子，并选择性地清除表达HBV的细胞，从而降低HBV复制[33]。KRUSE等[34]设计出一种针对HBsAg的CAR，以其构建的CAR-T淋巴细胞在体外能够识别HBsAg颗粒和HBV+细胞，在人肝嵌合小鼠模型中能有效降低HBV-DNA和HBsAg水平。WISSKIRCHEN等[26]设计出能够识别欧洲和亚洲HLA-A2亚型的高亲和力HBV包膜或核心特异性TCR，将TCR移植的T淋巴细胞单次转移到HBV感染的人源化小鼠中，病毒学标志物下降了4log10～5log10或低于检测下限，显示出强大的抗病毒潜力；当只有少数肝细胞被感染时，工程T淋巴细胞可特异性清除受感染的肝细胞，而不损害正常肝细胞。

虽然CAR-T淋巴细胞有着更广泛的适用性，且不存在与内源性TCR链错配的风险，但它们基于抗体的抗原识别结构域通常不像天然T淋巴细胞受体那样敏感，需要更高的抗原负载才能激活T淋巴细胞；同时，生产CAR-T淋巴细胞需要专门的人员和基础设施，经济成本非常高，而且目前仍没有研究表明该方法能够安全有效地用于人类。这些都是工程化T淋巴细胞用于临床亟待解决的问题。

随着我们对CHB免疫发病机制的理解不断完善，对于CHB免疫治疗方式也有了新的认识，越来越多的免疫治疗策略用来调节先天免疫和适应性免疫系统，通过宿主的先天性免疫应答和适应性免疫应答来控制HBV。CHB感染被认为是HBV特异性免疫耐受的结果，免疫治疗可以打破免疫耐受和恢复HBV特异性免疫反应，在减少或消除cccDNA方面同样具有巨大的潜力。即使目前免疫治疗的新型药物和生物制剂的疗效及安全性仍存在较大的争议，但随着免疫治疗领域的不断研究，会出现更多的新技术，提供更有效的免疫调节剂配合NUCs使用，有望在不久的将来实现CHB的彻底治愈。