利用流式细胞仪快速鉴定棉花倍性的方法比较

王娅丽 周利利 王娜 程红梅

（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

棉花（Gossypium hirsutumLinn.） 是锦葵科（Malvaceae）棉属（Gossypium）植物的种籽纤维，原产于亚热带。棉花不仅是重要的纤维作物和油料作物，也是含高蛋白的粮食作物和重要的战略物资，其主副产品都有很高的利用价值。棉属有53 种，包括46 个二倍体（2n=2x=26，基因组为A-G 和K）和7 个四倍体（2n=4x=52，基因组为AD）［1］。目前种植的栽培棉大部分都是四倍体，如陆地棉和海岛棉。倍性育种是指利用人工诱发植物染色体数目变异的材料选育新品种或新种质的育种技术，包括染色体加倍的多倍体育种和染色体减半的单倍体育种，其最大的优势是可缩短育种年限［2］。

在倍性育种及其应用过程中，需要对种子的纯度进行检测，以了解混合群体的遗传背景和遗传效应，因此倍性鉴定就显得至关重要。传统的细胞倍性鉴定方法有形态鉴定法、生理生化指标鉴定法、生育状况鉴定法、细胞学鉴定法和染色体计数法等［3］。这些方法已在多种植物中应用，如西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.et Nakai）［4］、金鱼草（Antirrhinum majusL.）［5］、白菜（Brassica rapa var.GlabraRegel）［6］、葡萄（Vitis viniferaL.）［7］等。棉花的倍性鉴定方法有多种，Mustafa 等［8］利用细胞学鉴定法分析了3 种二倍体棉花经秋水仙素处理后染色体的数目。王坤波等通过荧光原位杂交（FISH）进行了草棉［9］和海岛棉［10］的核型分析。Hao 等［11］利用基因组原位杂交（GISH），对亚洲棉和比克氏棉杂交后代的根细胞染色体进行核型分析，结果表明该杂交后代为异源四倍体。但这些传统的检测方法存在材料易受环境因素影响、实验操作困难等不足。

流式细胞分析是一种现代分析技术，其在生物学和医学领域被广泛使用，具有“实验室的CT”之称。虽然流式细胞术在植物研究中起步较晚，但由于它具有制样简单用量少、操作高效快速且数据重复性高等优势，已逐渐发展为一种常用的植物基因组大小［12-15］或植物倍性研究方法［16-17］。闫东玲等［18］应用流式细胞术检测了东北地区6 种主要越桔属（Vaccinium vitisidaeaL.）植物的染色体倍性。田路明等［19］采用流式细胞仪鉴定了21 种梨（Pyrus spp）种质资源的倍性。闫蕊等［20］采用流式细胞仪鉴定了97 份油茶（Camellia oleiferaAbel.）种质资源的染色体倍性。闫佼［21］利用流式细胞术完成了183 份栽培香蕉和野生香蕉（Musa nanaLour.）以及杂交后代的倍性分析。目前棉花中利用流式细胞仪检测细胞染色体倍性的方法较少，因此，本研究建立了一种利用流式细胞仪快速检测棉花细胞倍性的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 珂字棉312 老叶和嫩叶均采自本实验室温室。在盛花期取棉花的嫩叶和老叶，置于冰盒中带回实验室，用预冷的清水洗去叶片表面的灰尘，然后用吸水纸擦干备用。

1.1.2 试剂及仪器设备 WPB 解离液（0.2 mol/L Tris-HCl，4 mmol/L MgCl2·6H2O，2 mmol/L EDTA·Na2·2H2O，86 mmol/L NaCl，10 mmol/L 焦亚硫酸钠，1% PVP-10 和1%（V/V）Triton X-100）和LB01 解离液（15 mmol/L Tris，2 mmol/L Na2EDTA，0.5 mmol/L 四盐酸精胺，80 mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，0.1%（V/V）Triton X-100 和15 mmol/L β 巯基乙醇），均购自北京酷来搏科技有限公司。PI染色液购自北京百灵威科技有限公司。LSRFortessa型流式细胞仪（美国BD 公司）。

1.2 方法

去除主脉的棉花嫩叶和老叶各取两份，分别放至预冷的一次性塑料培养皿中，其中一份加入3 mL预冷的WPB 解离液，另一份加入3 mL 预冷的LB01解离液，并使叶片完全浸没在解离液中。用预冷的刀片垂直快速切碎叶片，静置10 min 以获得完整的细胞核。再用70 μm 滤膜将悬浮液过滤至2 mL 离心管中，随后加入25 μL RNase A，轻柔颠倒混匀后静置5 min。再加入50 μL 预冷的荧光染料PI，颠倒混匀后4℃避光染色5 min。最后将制备好的细胞核悬浮液移至上样管，上机检测，用BD FACSDiva 软件进行数据分析。

2 结果

不同解离液解离不同棉花叶片的细胞核相对DNA 含量结果如图1所示。LB01 解离棉花老叶制备的细胞核悬浮液经染色后上机检测，得到的碎片较多，杂峰面积较大而无法形成正常的主峰，且收集到的细胞核数目较少。与老叶相比，LB01 解离棉花嫩叶制备的细胞核悬浮液经染色后上机检测，虽然收集到的细胞核数目依然不多，但能看到大概的峰型，只是杂峰面积依然较大，仍不能形成明显的主峰。WPB 解离棉花老叶和嫩叶制备的细胞核悬浮液经染色后上机检测，可以看到二者都可以得到单一的主峰，但WPB 解离棉花老叶得到的峰图中存在一些背景碎片，而解离棉花嫩叶得到主峰离子团清晰而集中，背景碎片少，峰图效果较好，可以得到明显的主峰；杂峰更少，且收集到的细胞核数目更多。以上结果表明，WPB 提取棉花细胞核的效果明显优于LB01，棉花嫩叶较老叶更宜作为倍性检测的材料。

图1 不同解离液解离不同棉花叶片的细胞核相对DNA 含量Fig.1 Nucleus relative DNA contents of cotton leaves dissociated by different dissociation solutions

3 讨论

植物的核DNA 含量和倍性水平是植物学研究中重要的基础研究指标。流式细胞术的应用，提高了植物核DNA 含量检测的准确度和检测速度。提取高质量的细胞核用于倍性检测至关重要，Peng 等［22］比较了刀切法和研磨法提取棉花细胞核的效果，结果发现，刀切法提取的细胞核质量更高，因此我们选择刀切法来提取棉花细胞核。根据其他植物材料已有的研究报道，植物取材需要考虑样品易获性、细胞核型的稳定性和保存性等因素。如果材料选取不当，会导致提取的细胞核颗粒较少，生成大量的杂质，甚至形成变异系数较大的DNA 峰。本研究以棉花的老叶和嫩叶为材料制备样品进行对比，结果表明棉花幼嫩叶片检测效果好，完全可以作为倍性鉴定试材。

不同的检测样品有不同的特性，为了尽可能降低内源物质对检测结果的影响，需要明晰检测样本的特性［2］。棉花是多糖多酚植物，这些糖类和酚类物质会影响提取的细胞核纯度［22］。除物理破碎外，还需加入特定的解离液，使植物细胞破碎，分散细胞器，进而解离出细胞核。此外，解离液还可以防止细胞间相互粘连，抵消次生代谢物带来的消极影响，并维持一定的渗透压，保证细胞核的完整性。如果解离液和待测材料不匹配，不仅不能保证细胞核形态的完整性，还可能促进细胞核的破碎。因此筛选适宜提取细胞核的解离液，制备高纯度的单颗粒细胞核悬浮液，对倍性检测至关重要。本研究根据已有的文献报道选取了WPB 解离液和LB01 解离液，二者最大的区别就是WPB 解离液里面含有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）［23］，在制备棉花细胞核悬液时加入体积浓度为1%的PVP 可去除酚类等物质，减少干扰。结果表明，含有PVP 的解离液提取的细胞核成峰效果更好。

流式细胞仪测定染色体含量，是以大量染色体荧光峰的荧光强度值表示染色体的相对含量，但无法反应更具体的染色体其他信息，如染色体形态特征、核型分类等。流式细胞仪克服了传统鉴定方法操作难、时间长等不足，可进行快速、大量的染色体倍性分析，为后续棉花倍性育种提供技术支撑。

4 结论

本实验比较了WPB 和LB0 解离液制备棉花嫩叶和老叶细胞核悬液流式细胞术检测效果。结果表明WPB 解离液提取棉花嫩叶细胞核检测效果更好。