植物观赏器官中类胡萝卜素代谢调控的研究进展

田清尹 岳远征 申慧敏 潘多 杨秀莲 王良桂

（1.南京林业大学风景园林学院 南京 210037；2.南京林业大学风景园林江苏省重点实验室，南京 210037）

类胡萝卜素（carotenoids）是一类重要的脂溶性色素，呈链状或环状，由碳氢化合物及其含氧衍生物组成，广泛存在于各种动植物和微生物之中。作为次生代谢物，类胡萝卜素不仅在植物的生长发育过程中参与或调控许多重要的生理进程，而且也是人体所需的重要营养物质［1］。在植物中，类胡萝卜素赋予植物的花、叶及果实鲜艳色彩，既提高了观赏价值，又可以吸引昆虫传播花粉促进自身的繁衍。同时，类胡萝卜素在植物生长发育、光合作用以及植物激素和挥发性物质的产生中也有着重要作用［2］。

植物观赏器官包括花、果、叶等，其色彩和香味是植物重要的观赏性状。积累在植物观赏器官中不同类型的类胡萝卜素促进了不同色彩的形成，例如番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素的积累分别呈现红色、橙黄色和黄色［3］。同时类胡萝卜素裂解后产生多种类型的脱辅基类胡萝卜素，也可以为植物提供不同的色泽和香味，如在藏红花（Crocus sativus）中，藏红花素和藏红花醛是其柱头颜色和风味的主要来源［4］。鉴于类胡萝卜素在调控植物重要观赏器官着色及香气物质产生等方面的重要意义，本文对类胡萝卜素代谢调控植物花、果、叶的色香变化进行了总结，为人工干预调节植物中类胡萝卜素的种类或含量，进而提高植物的观赏价值提供参考。

1 类胡萝卜素代谢途径及其调控机制

1.1 类胡萝卜素合成和降解途径

1.1.1 类胡萝卜素的生物合成 目前，类胡萝卜素代谢途径已被广泛研究（图1）［3］。在植物中，类胡萝卜素的前体物质是经由甲基赤藓糖醇途径（methyl erythritol phosphate，MEP）产生的两种异戊二烯异构体：异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）［5］。三分子IPP 和一分子DMAPP 在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）的催化下合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）。值得注意的是，IPP 和DMAPP 是类胡萝卜素与单萜、倍半萜等挥发性物质合成的共同底物，因此，控制IPP 和DMAPP 的流向是植物色彩和香味改良的重要手段［6］。

图1 类胡萝卜素合成、降解途径Fig.1 Pathways of carotenoid synthesis and degradation

类胡萝卜素的生物合成始于八氢番茄红素合酶（phytoene synthase，PSY）催化两分子GGPP 缩合，形成无色的15-顺式-八氢番茄红素。然后依次经过八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）、ζ-胡萝卜素脱氢酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）催化脱氢，ζ-胡萝卜素异构酶（ζ-carotene isomerase，Z-ISO）、类胡萝卜素异构酶（carotene isomerase，CRTISO）催化异构形成红色的番茄红素。番茄红素的环化是类胡萝卜素生物合成途径的重要分支点［7］，番茄红素在番茄红素ε-环化酶（lycopene ε-cyclase，LCYE）和番茄红素β-环化酶（lycopene β-cyclase，LCYB）共同催化下，生成α-胡萝卜素，而仅在LCYB 的催化下，则产生β-胡萝卜素。随后，含血红素的细胞色素P450 型羟化酶（cytochrome P450 carotene hydroxylase，CYP）催化α-胡萝卜素形成叶黄素；非血红素β-环羟化酶（β-carotene hydrolase，BCH）催化β-胡萝卜素，依次形成β-隐黄质和玉米黄质。玉米黄质通过玉米黄质环氧酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）环氧化产生环氧玉米黄质和紫黄质，紫黄质则可经紫黄质脱环氧酶（violaxanthin deepoxidase，VDE）重新生成玉米黄质，或是在新黄质合成酶（neoxanthin synthase，NXS）的作用下，形成新黄质。此外，在辣椒（Capsicum annuum）和卷丹（Lilium lancifolium）中，环氧玉米黄质和紫黄质在辣椒红素合酶（capsanthin-capsorubin synthase，CCS）的催化下转化为辣椒红素和辣椒黄素，呈现独特的红色和橙色［8-9］。

1.1.2 类胡萝卜素降解途径 类胡萝卜素降解主要包括非特异性机制氧化（如光化学氧化）、非特异性酶分解（脂氧合酶和过氧化物酶）以及类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs）裂解［10］。在植物中，由CCDs 催化的酶促反应是类胡萝卜素降解的主要方式［11］。CCDs 家族根据功能不同被分为两个亚家族：（1）9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED），特异参与脱落酸前体的产生；（2）类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD），能够催化降解不同的类胡萝卜素生成多种类型的脱辅基类胡萝卜素，如β-柠檬酸［12］和β-紫罗兰酮［13］等，在植物的色素沉积、挥发物质合成等方面有着重要作用。

1.2 类胡萝卜素代谢分子调控机制

1.2.1 转录因子调控 转录因子（TFs）是一种能够识别和结合基因5′端上游特定序列并调控基因表达的蛋白质，在类胡萝卜素结构基因的转录激活或抑制中发挥关键作用。在植物的花器官中，类胡萝卜素代谢途径的结构基因受到一些转录因子间接或直接的调控（图2-A）。RCP1（reduced carotenoid pigmentation 1）是第一个被报道的花特异性转录因子，属于R2R3-MYB 基因家族，在猴面花（Mimulus lewisii）的花发育过程中正向调控整个类胡萝卜素合成途径；之后发现的RCP2也具有类似功能，但是RCP1与RCP2是否直接调控类胡萝卜素生物合成基因的表达尚不清楚［14-15］。而同基因家族的WHITE PETAL1（WP1）则被证明其作为转录激活因子直接调节蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）花瓣中MtLYCE和MtLYCB等基因的表达，进而调节花瓣中类胡萝卜素色素沉着［16］；在桂花（Osmanthus fragrans）中，OfWRKY3、OfERF61可以直接与OfCCD4启动子相互作用，促进类胡萝卜素裂解形成β-紫罗兰酮［17-18］。

在植物果实中，已报道参与类胡萝卜素代谢的转录因子有MADS-box、SPL、NAC、AP2/ERF、bHLH等，这些转录因子多与果实发育、乙烯生物合成和光形态建成有关（图2-B）。MADS-box编码的转录因子参与调控果实成熟，在番茄（Solanum lycopersicum）中，SlRIN通过促进番茄红素的合成并抑制其环化，参与番茄红素的积累，SlFUL1/2 则调节整个类胡萝卜素代谢途径［19-20］；SPL转录因子与果实生长调控相关，在香蕉（Musa nana）中，MaSPL16直接结合MaLCYB1.1和MaLCYB1.2的启动子，正向调节类胡萝卜素合成［21］；SlNAC1被报道参与乙烯的生物合成，同时SlNAC1可以与SlPSY1相互作用，抑制番茄果实中总类胡萝卜素和番茄红素的积累［22］；AP2/ERF是乙烯响应因子，在柑橘（Citrus sinensis）中，由乙烯诱导的CsERF061作为正向调节因子，直接激活CsLCYb2和其他关键类胡萝卜素途径基因的启动子［23］；BBX-box在光信号传导中起重要作用，SlBBX20直接与SlPSY1的启动子结合并激活其表达，促进番茄叶片和果实中类胡萝卜素的生物合成［24］；光敏色素互作因子（PIF）属于bHLH 家族，与SlPSY启动子的G-box 光响应元件特异结合，从而抑制SlPSY的表达和番茄中类胡萝卜素的积累。此外，在木瓜（Carica papaya）中，CpBHLH1/2也参与了光介导的类胡萝卜素合成调控［25-26］。

在植物的叶片中，仅少数调控类胡萝卜素代谢的转录因子被鉴定出来（图2-C）。例如PIF1和HY5，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中直接调控AtPSY的表达以响应光/暗周期和温度的变化［27］；AtRAP2.2在体外被证明能结合AtPSY和AtPDS启动子，然而在拟南芥叶片中过表达AtRAP2.2并没有导致AtPSY或AtPDS转录水平升高，也没有改变类胡萝卜素的含量，因此还需要进一步研究相关的调控机制［28］。

图2 花、果、叶中类胡萝卜素代谢调控图Fig.2 Regulation of carotenoid metabolism in flowers，fruits and leaves

1.2.2 表观遗传调控 类胡萝卜素代谢的表观遗传调控主要有组蛋白修饰、DNA 甲基化和miRNA 介导的转录后基因沉默等。首先，组蛋白修饰包括泛素化、乙酰化、磷酸化和甲基化等，是一种可逆的表观遗传修饰。番茄E3 泛素连接酶（PPSR1）通过泛素化介导PSY 蛋白降解，研究表明PPSR1 功能丧失会导致果实中类胡萝卜素含量增加［29］；沉默组蛋白去乙酰化酶（SlHDT3）可以延缓番茄果实成熟并抑制类胡萝卜素的积累［30］。其次，DNA 甲基化对相关基因转录的抑制作用也会影响类胡萝卜素的合成和降解，在拟南芥的组蛋白甲基转移酶（SDG8）缺失突变体中，关键基因CRTISO的染色质甲基化状态改变、表达水平降低，导致叶黄素合成减少［31］。此外，miRNAs 作为植物体内重要的调节因子，也参与调控类胡萝卜素代谢，例如csi-miR1857 靶向LCYB基因进而调控柑橘红肉突变体中番茄红素的积累［32］；在番茄中，7 个与类胡萝卜素生物合成相关的miRNA 被报道，其中miR169i-5p2 和miR1027a、miR482、miR172、miR396、miR395 分别靶向PSY、ZDS、CRTISO、LCYB、ZEP等关键的类胡萝卜素合成酶基因［33］。

2 类胡萝卜素代谢对植物花色和花香的影响

2.1 类胡萝卜素相关基因对花色的影响

植物花瓣中类胡萝卜素含量变化会导致花色改变，而其含量变化受到类胡萝卜素代谢途径中关键酶基因转录水平的影响。PSY 是类胡萝卜素合成的重要限速酶，抑制文心兰（Oncidium‘Gower Ramsey’）中OgPSY的转录会导致花瓣中类胡萝卜素积累显著下降，花色由黄色变为白色［34］。在欧洲油菜（Brassica napus）‘ywf’突变体中，由于BnaA08.PDS3基因突变，阻断了类胡萝卜素的生物合成途径，从而导致类胡萝卜素含量下降和黄白色花瓣表型［35］；CoCRTISO1是引起金盏花（Calendula officinalis）花瓣颜色差异的关键基因，黄色花瓣中CoCRTISO1 催化顺式番茄红素转化为反式番茄红素，经环化、羟基化后最终积累黄色的叶黄素，而橙色花瓣中CoCRTISO1 酶活性较低而无法催化异构，积累红色的5-顺式番茄红素［36］；CsLCYB2a的表达水平与番红花柱头的类胡萝卜素含量呈正相关，并影响其柱头的颜色［37］；InCHYB的转录水平不同被认为是牵牛花（Ipomoea nil）的白色和黄色花瓣之间类胡萝卜素差异的关键［38］；BnaC09.ZEP和BnaA09.ZEP的缺失引起欧洲油菜花瓣中类胡萝卜素含量以及颜色的改变［39］。

类胡萝卜素的降解多与白花的形成有关，文心兰‘White Jade’的白花性状是由OgCCD1的上调引起的，同时在‘Gower Ramsey’的黄色唇部组织中瞬时表达OgCCD1，出现白色斑点［40］；落叶黄花杜鹃（Rhododendron japonicum）和常绿白花杜鹃的杂交种在花开放时颜色由黄变白，主要是由亲本常绿白花杜鹃中CCD4基因高表达介导的［41］。此外，CCD4功能的破坏往往会导致花瓣颜色的差异，如大豆（Glycine max）‘gmicc’突变体的黄色花朵是由于GmCCD4 蛋白功能丧失导致的［42］；菊花（Chrysanthemum morifolium）中CmCCD4a的缺失使得花色从白色变为黄色［43］；欧洲油菜黄色花瓣的形成与转座子插入导致CCD4功能丧失密切相关［44］。

2.2 类胡萝卜素相关基因对花香的影响

类胡萝卜素经CCDs 裂解产生的脱辅基类胡萝卜素，如β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛和β-大马酮等芳香物质的香气阈值极低，因此即使这些物质的含量较低，也对花瓣整体香气的感知有强烈影响。突厥蔷薇（Rosa damascena）是一种著名的香花植物，它的香气物质主要是由RdCCD1 分别切割新黄质和β-胡萝卜素产生的β-大马酮和β-紫罗兰酮［45］；在矮牵牛（Petunia hybrida）中，PhCCD1被证明参与β-紫罗兰酮和香叶基丙酮等香味物质的形成［46］。在藏红花柱头发育过程中，CCD4 酶活性增强有助于挥发性β-紫罗兰酮的产生［4］；OfCCD4也是桂花花瓣中产生β-紫罗兰酮关键基因，由于OfCCD4在‘银桂’和‘丹桂’的表达差异，‘银桂’中β-紫罗兰酮含量明显高于‘丹桂’［17-18］。同时，CCD4的表达差异可以同时影响花瓣的色香，百合（Lilium brownii）在开花后第二天花被片产生强烈香味，且颜色从黄色变成白色，经研究发现LbCCD4可能是控制百合开花过程中色香变化的关键基因［47］。

3 类胡萝卜素代谢对植物果实色泽与风味的影响

3.1 类胡萝卜素相关基因对果实色泽的影响

类胡萝卜素相关基因的表达差异往往会导致果实中色素沉着的多样性。目前利用突变体揭示类胡萝卜素合成基因的转录变化对于果实色素沉着影响的研究被陆续报道，番茄γ 突变体由于基因组中插入转座子导致SlPSY-1转录异常无法积累类胡萝卜素而形成黄色果肉［48］；黄色‘Pinalate’甜橙突变体的产生原因是CsZ-ISO中单核苷酸插入突变，从而使得早期上游类胡萝卜素的大量积累［49］；番茄‘tangerine’突变体中，CRTISO 酶失活导致顺式番茄红素的积累，从而产生粉橙色表型［50］，此外在甜瓜（Cucumis melo）‘yofI’突变体和柠檬（Citrus limon）芽变体中也存在类似表型［51-52］。番茄红素的含量与番茄红素ε-或β-环化酶的转录水平密切相关。木瓜果肉呈现红色的主要原因是CpLCYb2基因的插入突变导致番茄红素环化酶的失活，引起番茄红素积累［53］，这与柑橘红色果实的形成机制相同［7］。此外，在辣椒中，β-胡萝卜素羟化酶（CHY2）突变导致β-胡萝卜素及其衍生挥发物的积累，果实颜色由红色向橙色的转化［54］；CaZEP突变使得玉米黄质环氧酶活性降低，从而使得辣椒中玉米黄质与总类胡萝卜素含量增加，颜色由黄色变为橙色［55］。

有色的类胡萝卜素经CCDs 降解可以生成无色的衍生物，从而对果实颜色产生影响。其中最典型的例子是桃（Prunus persica），白果肉中类胡萝卜素含量只有黄果肉的含量的十分之一，研究发现由于黄果肉中CCD4的突变导致类胡萝卜素积累［56］，随后利用VIGS 技术敲除了白桃中的CCD4基因，发现黄色色素沉着和类胡萝卜素含量增加，证明了CCD4是控制桃果肉颜色变化的关键基因［57］。此外，类胡萝卜素还可以降解为有色物质，如β-柠檬酸是一种C30 类胡萝卜素，由CCD4 酶切割β-隐黄质和玉米黄质形成，使得柑橘类果实呈现红色［12］。

3.2 类胡萝卜素相关基因对果实香味的影响

CCD1 和CCD4 通过裂解类胡萝卜素生成挥发性萜类化合物，进而调节果实的风味和香气。在葡萄（Vitis vinifera）中，VvCCD1 催化β-胡萝卜素裂解形成β-紫罗兰酮；而VvCCD4b 催化ζ-胡萝卜素裂解形成香叶基丙酮［58］。在番茄中，抑制LeCCD1A和LeCCD1B基因的表达会导致β-紫罗兰酮和香叶基丙酮含量的下降［59］。同时，在甜瓜、杏（Prunus america）、无花果（Ficus carica）等果实中也存在多种挥发性脱辅基类胡萝卜素，其种类和含量均与CCD1 酶切割类胡萝卜素密切相关［60-62］。但是有研究表明，CCD1的表达趋势并不能准确的反映出挥发性脱辅基类胡萝卜素的含量变化，其原因可能是CCD1定位于细胞质中，而裂解底物位于质体中［10］。

4 类胡萝卜素代谢对植物叶片色彩与香味的影响

4.1 类胡萝卜素相关基因对叶色的影响

叶色是观赏植物易识别的表型特征，也是重要的观赏性状之一。类胡萝卜素相关基因转录水平的改变对叶色的变化起到重要作用，例如在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中，导入番茄PSY的过表达载体，使得叶片积累大量八氢番茄红素，植株呈亮橙色［63］；过表达BoaNXS的转基因芥蓝（Brassica oleracea）植株叶片中新黄质、紫黄质、叶黄素等含量显著增加，叶色由绿色变为黄绿色［64］。此外，黄叶突变体的产生多与类胡萝卜素含量变化有关，在银杏金叶突变体中，上调的Z-ISO、ZDS和LCYE 促进了类胡萝卜素尤其是叶黄素的积累［65］；类胡萝卜素异构酶（BrCRTISO）的功能丧失导致前番茄红素积累，使得大白菜（Brassica rapa）内叶呈现橘红色［66］；小麦（Triticum aestivum）黄叶突变体中BCH表达水平较绿叶表型上调，导致总类胡萝卜素含量显著降低，而玉米黄质含量升高［67］。

4.2 类胡萝卜素相关基因对叶片香味的影响

类胡萝卜素是植物叶片中重要香气成分的前体物质，目前类胡萝卜素调控叶片香气物质产生的研究，仅在茶叶（Camellia sinensis）、烟草（Nicotiana tabacum）以及香露兜（Pandanus amaryllifolius）等植物中被报道。在制茶过程中，CsCCD1a和CsCCD4共同参与裂解β-胡萝卜素生成β-紫罗酮，最终贡献了茶叶中的花果香味［68-69］。在烟草叶片中，NtCCD1是催化类胡萝卜素降解产生醛类与酮类物质的关键基因［70］，而NtLcy-b基因过表达可以增加β-胡萝卜素含量，进而提高了β-胡萝卜素降解产物，如β-二氢大马酮、β-环柠檬醛等香气物质的含量［71］。同时，香露兜作为天然香料，在其叶片中鉴定出的α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮和β-环柠檬醛等挥发性芳香物质也主要由α-胡萝卜素和β-胡萝卜素在类胡萝卜素裂解酶的催化下生成［72］。

5 基因工程技术在改良植物观赏器官中类胡萝卜素的应用

定性或定量改变类胡萝卜素种类和含量，提高植物观赏价值是植物育种的重要目标。随着转基因技术的不断发展，人们通过尝试过表达外源基因，或者抑制内源基因表达和基因敲除等手段对类胡萝卜素代谢途径进行人为干预，从而改变类胡萝卜素的种类或含量以实现植物重要观赏器官色彩和香味的改良（表1）。

表1 基因工程技术利用类胡萝卜素代谢相关基因在改植物良观赏品质的应用Table 1 Application of genetic engineering technology in improving good ornamental characters of plants using carotenoid metabolism related genes

5.1 过表达外源基因

过表达外源基因是植物基因工程的常用技术，通过设计代谢途径积累特定的类胡萝卜素，可以使植物产生特定的颜色或香味。虾青素是一种价值极高的酮类胡萝卜素，仅在少数生物体中低水平合成，通过叶绿体转化莱茵衣藻酮酶基因（BKT）的方法，在转基因烟草叶片中积累虾青素和其他酮类胡萝卜素，花色也产生了明显的改变［78］；同时利用农杆菌介导的方法将crtW基因导入百脉根（Lotus japonicus），转基因植株积累酮类胡萝卜素，花瓣从浅黄色变为深黄色或橙色［74］。此外，叶黄素酯化可以促进植物花瓣中叶黄素的积累，将小心叶薯（Ipomoea obscura）、番茄和万寿菊（Tagetes erecta）的叶黄素酯酶基因（XES）引入一个淡黄色花的矮牵牛品种中，类胡萝卜素含量和酯化叶黄素的比例升高，颜色呈现更深的黄色［73］。综上所述，导入植物体中缺少或低效表达的外源基因为改变植物观赏器官中类胡萝卜素的种类和含量提供了一种独特而有效的策略。

5.2 RNAi技术

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种转录后基因沉默现象，利用RNAi 技术，可降低靶基因的表达，而不会彻底敲除目标基因。在文心兰中，通过RNAi 抑制PSY的表达，花的颜色从亮黄色变为白色或黄白色，叶片呈现黄绿色，且此性状具有遗传稳定性［34］；下调BCH-A2和BCH-B2的表达，花瓣呈浅黄色和白黄色［79］。在番茄中，利用RNAi干扰SlZDS的表达，β-胡萝卜素和番茄红素缺失，果实由红色变为白绿色，且叶片存在光漂白现象［81］；降低SlCCD1的表达能够提高番茄果实中类胡萝卜素的含量，同时减少香气物质的产生［59］。因此，RNAi 技术在定向改良植物性状中极具应用价值。

5.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术

新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9 可以通过改变单个基因或一小套基因来操纵重要性状，与RNAi等基因的抑制技术相比，CRISPR/Cas9 的基因敲除技术加快了分子改良育种的进程。在牵牛花中，通过构建CRISPR/Cas9 系统对InCCD4进行编辑，使得花色由白色到浅黄色的转变，花瓣中的类胡萝卜素含量显著增加［83］；在番茄中，敲除Psy1和CrtR-b2，产生白花、黄肉表型［84］；在芥蓝中，利用CRISPR/Cas9 编辑技术和农杆菌介导的稳定转化的方法，抑制BoaCRTISO基因的表达，获得颜色更加鲜艳的黄色芥蓝植株［86］。CRISPR/Cas9 技术作为一种应用广泛的基因编辑技术，为植物观赏器官色香改良的研究提供了新的方法。

6 展望

作为调控植物观赏性状的一个重要因子，类胡萝卜素不仅是一类天然色素，赋予植物多样的色彩，而且还是脱辅基类胡萝卜素合成的前体，对于植物观赏器官香味的产生有重要的作用。因此研究类胡萝卜素在调控植物花、果、叶的着色及香气物质产生等方面具有重要意义，例如研究类胡萝卜素的调节机制，包括转录调控、表观遗传调控等调控网络，能够更好地揭示植物观赏器官中类胡萝卜素代谢的具体机理；挖掘类胡萝卜素代谢途径关键基因，为利用基因编辑技术定向改良植物色彩和香味提供基因资源。

目前对于类胡萝卜素的研究大多集中在模式植物以及植物的花和果实中，在叶片中的研究尚少。彩叶的形成机制较为复杂，通常涉及叶绿素、类胡萝卜素、花青素等多种代谢途径，因此，如何培育出叶色靓丽的观赏植物，值得进一步探讨。另外，目前利用类胡萝卜素改良植物观赏性状多针对于改变色素沉着，而香味物质产生的研究相对较少，且多着重于类胡萝卜素的降解，迄今为止，还未解开类胡萝卜素与单萜和倍半萜等香气物质合成之间的竞争机制，这仍是一个重要的研究方向。近年来随着植物分子育种技术的发展，利用基因工程技术改良植物观赏性状已经实现，因此深入解析植物观赏器官中类胡萝卜素的代谢调控可为定向培育色香俱佳的植物新品种提供了理论支持。