高效液相色谱法测定巧克力食品中7 种合成着色剂的研究

张海神，周瑞铮，莫淑梅

（东莞市食品药品检验所，广东东莞 523000）

随着生活水平的提高，人们对食品的要求日趋严格，在充分注重安全性的前提下，也格外注重口感和外观。合成色素因具有赋予食品色泽和改善食品色泽的特质，在现代食品加工业中被广泛应用[1]，但合成色素大多数对人体有害[2]，具有潜在的致泄性、脏器功能损害与致癌性。因此，我国国家标准对食品中合成色素的最大使用量和检出限做出了明确规定。目前，通用的合成色素检测方法[3]主要有高效液相色谱法[4-6]、固相萃取-超高效液相色谱法[7-8]、全自动固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法[9]、紫外分光光度法[10]、电分析化学法[11]。在休闲食品中，巧克力食品因其独特的口味广受消费者喜爱，市面上巧克力制品种类繁多，国家标准虽然明确规定了巧克力制品的检测方法，但在日常工作过程中发现，使用高效液相色谱法，按照国家标准GB 5009.35—2016 检测，柠檬黄和新红两色谱峰出峰时间过于紧密、分离度差、难以定量，不利于食品安全检测工作进行。基于国家标准优化色谱条件同时测定巧克力食品中7 种合成色素，以期为实验室测定合成色素提供参考意见。

1 试验部分

1.1 材料

1.1.1 仪器

U-3000 型高效液相色谱仪，戴安公司产品；带二级管阵列检测器DAD；HWS-24 型电热恒温水浴锅，泰斯特公司产品；纯水仪，密理博公司产品。

1.1.2 试剂

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），Fisher 公司提供；0.02 mol/L 乙酸铵溶液；聚酰胺粉；纯水（为GB/T 6682 规定的一级水）。

1.2 试验步骤

1.2.1 样品预处理

参照国家标准GB 5009.35—2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》[12]进行样品前处理。

1.2.2 标准溶液配制

将上述7 种标准品配制成质量浓度为100 μg/mL标准储备液，用移液管稀释成0.5，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 质量浓度工作梯度。

2 结果与分析

2.1 方法优化对比

优化国标色谱条件，在波长为254 nm 条件下，高效液相色谱仪分析，二极管阵列器检测，甲醇+乙腈（1∶1）和0.02 mol/L 乙酸铵溶液梯度洗脱，外标法定量。

国标方法与改进方法对比见表1。

表1 国标方法与改进方法对比

2.2 仪器条件

色谱柱型号：C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱温35 ℃，进样量10 μL；二极管阵列检测器，波长254 nm；流动相A 为甲醇，流动相B 为0.02 mol/L乙酸铵溶液，流动相D 为乙腈（甲醇∶乙腈=1∶1）；流速为1.0 mL/min。

梯度洗脱条件见表2。

2.3 色谱图

7 种合成色素色谱条件优化后图谱（波长254 nm）见图2。

图2 7 种合成色素色谱条件优化后图谱（波长254 nm）

优化前柠檬黄和新红两色谱峰的保留时间差为0.21 min，优化后的保留时间差为0.28 min。表明此优化方式能够有效分离柠檬黄和新红，减少两峰黏连，同时其他5 种色素分离效果较好。

2.4 线性方程和检出限

2.4.1 线性方程

以响应峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标做工作曲线。

7 种合成色素的保留时间、线性关系和相关系数见表3。

表3 7 种合成色素的保留时间、线性关系和相关系数

由表3 可知，质量浓度为0.5～20.0 μg/mL 时，7 种合成色素相关系数为0.999 8～0.999 9，线性关系好。

2.4.2 方法检出限

取曲线低点进行测试10 次，取其信噪比，3 倍信噪比计算检出限，10 倍信噪比计算定量限见表4。

7 种合成色素的优化方法定量限、检出限和国标检出限见表4。

表4 7 种合成色素的优化方法定量限、检出限和国标检出限

由表4 可知，在吸收波长为254 nm 时，所测得检出限均低于标准要求的检出限，符合标准要求。

2.5 加标回收率和精密度

按照检出限低点，曲线的中点和高点或指标限量值进行加标，同样品一起前处理、测试，分3 个水平加标（即低点加标、中点加标、高点加标），每个水平重复测量6 次。

加标回收率和精密度见表5。

表5 加标回收率和精密度

由表5 可知，7 种不同色素的回收率为86.9%～98.3%，变异系数为0.5%～2.1%，均符合国家检测标准要求。

3 结语

按照GB 5009.35—2016 国家标准高效液相色谱法检测食品中合成色素，在实际工作中易出现柠檬黄和新红两色谱峰黏连现象，不易于工作进行。经过色谱条件的优化，巧克力产品中的7 种合成色素可以有效分离。色谱条件的优化可通过改变流动相溶剂组成和配比实现，参考朱彭玲梯度洗脱[13]，此改进方法通过增加溶剂乙腈增加流动相A 溶剂的极性，扩大流动相间的极性差，使每个流出的组分都有合适的容量因子，改善峰型，提高分离能力，实现各组分最佳分离。改进方法中采用甲醇+乙腈（1∶1）比例混合，在实现各组分充分分离条件下，既可以最大限度节约成本和降低色谱柱压力，又在一定程度上有效降低检测成本和仪器维护成本。优化方法检测巧克力食品中7 种合成色素分离效果良好，检出限、加标回收率和精密度均符合国家标准要求，在同类研究中，李媛媛等人[14]曾在高效液相色谱法同时测定食品中多种合成色素的方法探究一文中以0.02 mol/L 乙酸铵溶液和甲醇+乙腈（3∶1）为流动相使各组分有效分离，方法加标回收率为92.0%～99.5%，相对标准偏差为0.2%～1.4%，均优于改进方法的试验结果，但该改进方法使用的甲醇少，具有降低色谱柱压力、延长色谱柱使用寿命的优点，另结果存在差异的原因主要在于试验样品基质本底不同和试验前处理方法不同，故此改进方法可从这2 个方面继续优化改进。

采用优化后的色谱条件测定巧克力食品中7 种合成色素，能够有效分离7 种色谱峰，有利于企业开展检测工作，提高实验室检测效率，从而能给相关实验室提供参考作用。