产γ -氨基丁酸乳酸菌的高密度培养条件优化

徐启民，宋洪宁，曾思恒，何 娟，刘 军，李 丽，王风青

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000；2.山东泰山生力源集团股份有限公司，山东泰安 271000）

GABA 作为重要的抑制性神经递质在中枢神经系统中发挥着重要作用，被用于治疗各种神经系统疾病，如癫痫、精神分裂症和焦虑症等，GABA 还具有降压、利尿和镇静作用[1]，此外，口服GABA 可有效降低高血压患者的血压[2]。

目前生产γ -氨基丁酸的方法分为3 种：化学合成法、植物富集法和微生物发酵法[3]。其中，化学合成法是最早用于生产GABA 的方法，化学合成法生产过程中反应条件剧烈、能耗大、副产物多，采用的试剂多具有毒性、腐蚀性[4]，不符合绿色环保和可持续发展理念，特别是通过化学法合成的GABA不能应用于医药、食品、饲料等行业，因此化学法必将被取代。植物富集法植物在逆境的胁迫下体内GABA 含量会显著上升，可以在植物富集一定量的GABA。植物富集法安全环保，可以提高原材料的营养价值，但是生产效率低，所以分离提纯非常困难，不足满足市场的需求。例如，经过富集处理的GABA茶中GABA 的含量约为0.4%[5]，而自然发芽的糙米种子中GABA 含量不到0.05%[6]，因此植物富集法不适合大规模生产GABA，只适合用于GABA 富集农产品的生产。微生物合成是最为环保经济的合成途径，相较于其他方法更有优势[7]。微生物合成GABA，在研究和生产中常选择使用大肠杆菌、乳酸菌、酵母菌等微生物进行产GABA 的发酵。其中，乳酸菌是大量存在于人体肠道对人体有益无害的菌种，是常用的食品微生物，现在已经非常广泛地应用在生物制品和各种食品的发酵生产中，是用于生产富含GABA 发酵食品的最优菌种之一[8-9]。所以试验致力于通过单因素试验及响应面设计优化产GABA 植物乳杆菌LP-YX-1 培养基及培养条件，实现菌体高密度培养，添加合适冻干保护剂[10]冻干制备直投式发酵剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

植物乳杆菌YX-1，实验室分离纯化并保存。

蛋白胨（发酵级），北京鸿润宝顺科技有限公司提供；吐温80（分析纯），成都市科隆化学品有限公司提供；γ -氨基丁酸（分析纯），酷尔化学科技北京有限公司提供；奶粉（食用级），澳大利亚施普特乳制品私有公司提供。

1.1.2 试验仪器

UV752N 型紫外可见分光光度计，上海诺科仪器仪表有限公司产品；H10-50133 型生化培养箱，天津宏诺仪器有限公司产品；R1-TGC-N50 型高速离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司产品。

1.1.3 培养基

基础培养基及培养条件：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，聚山梨酯-80 1 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L（pH 值调节至6.0～6.4），接种量2%（V/V），于37 ℃下静置恒温培养24 h。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液制备

用接种环挑取斜面保藏菌种，接入50 mL 基础培养基中，37 ℃下恒温箱中静置培养16 h，得到活化后的种子液。

1.2.2 生长曲线的测定

将种子液以2%接种量接种于50 mL 基础培养基中，于37 ℃恒温箱中静置培养，每隔2 h 摇匀后取4 mL 菌液稀释至适宜倍数测定其OD600nm值，以培养时间和OD600nm值关系得到植物乳杆菌YX-1 的生长曲线[11]。

1.2.3 发酵培养基及培养条件的优化

（1）单因素试验。基于试验菌株高密度培养的需求，对于基础培养基中的碳氮源种类、浓度和培养条件进行单因素试验，试验中均以菌体浓度（OD600nm值）为衡量指标，具体单因素试验设计如下：

植物乳杆菌YX-1 最适碳源的确定：分别选用蔗糖、乳糖、果糖、豆渣粉代替基础培养基中的葡萄糖，将种子液以2%接种量接种到装有10 mL 不同碳源基础培养基的试管中，置于37 ℃培养箱中静置培养24 h，保持其他件不变，进行单因素试验[12]确定最佳碳源后，分别调整碳源质量浓度为15，20，25，30，35 g/L，以考查碳源质量浓度对菌体增殖的影响[13]；

植物乳杆菌YX-1 最适氮源的确定：分别选用尿素、氯化铵、硫酸铵、豆饼粉代替基础培养基中的蛋白胨，保持其他条件不变，进行单因素试验[14]，以考查氮源种类对菌体增殖的影响；

植物乳杆菌YX-1 增殖最适酵母粉[15]质量浓度的确定：分别调整基本培养基中酵母粉质量浓度为3，6，9，12，15 g/L，进行单因素试验，以考查酵母浸粉对菌体增殖的影响；

植物乳杆菌YX-1 最适pH 值的确定：使用盐酸和氢氧化钠溶液分别调整培养基初始pH 值至6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，其他成分质量浓度和培养条件不变，进行单因素试验以确定菌体增殖最适初始pH 值；

植物乳杆菌YX-1 最适接种量的确定：分别调整接种量为1%，2%，3%，4%，5%，其他成分质量浓度和培养条件不变，进行单因素试验，以确定菌体增殖最佳接种量；

植物乳杆菌YX-1 最适培养时间的确定：保持培养基的其他成分质量浓度和培养条件不变的情况下，分别培养12，24，36，48，60 h，以确定最佳培养时间。

（2）Plackett-Burman 设计。利用软件Minitab 19选择N=12 的Plackett-Burman 设计进行试验，共考查6 个因素：氮源浓度、碳源质量浓度、酵母粉质量浓度、接种量、pH 值和培养时间。每个因素取低水平和高水平，高水平质量浓度取值为低水平的1.5～2.0 倍，以培养液OD600nm为响应值。选择置信度大于95%（p＜0.05）的因素进行下一步试验。

（3）最陡爬坡试验。根据Plackett-Burman 设计的试验结果，可以确定显著因子的正负效应，在后续的爬坡试验中，正效应的因子取高水平以一定步长增大浓度，负效应的因子取低水平以一定步长降低浓度。设置适宜步长后可得爬坡试验设计，以培养液菌体浓度为响应值，菌体浓度最大的一组确定为中心点，随后进行下一步试验。

（4）响应面设计。根据最陡爬坡试验确定的中心点，利用软件Minitab 19 设计三因素三水平的响应面试验，通过试验结果可以拟合出描述自变量（各显著因子）和响应值（OD 值）关系的多项式回归方程，对拟合方程进行分析，即可得到响应值（OD600nm值）最大时各显著因素的水平。

1.2.4 植物乳杆菌YX-1 冻干菌粉的制备

利用上述试验得出的最佳条件培养得到菌液，将菌液分装至50 mL 离心管中常温下以转速6 000 r/min离心20 min。倒出上清液，加入适量无菌生理盐水振荡洗剂后，相同条件下再次离心得到菌泥。冻干保护剂和菌泥以3∶1 的比例充分混匀后得到菌悬液，将上述菌悬液平铺于洁净平板上用保鲜膜封口（每100 mL 菌液所得菌泥制作一个平板），放置在-20 ℃冰箱中预冻12 h，再将平板放置在真空冷冻干燥机中冻干24 h 得到干燥菌粉。保护剂配方为奶粉15 g/L，蔗糖20 g/L，糊精25 g/L，甘油3 mL/L。

1.3 检测方法

1.3.1 菌体密度测定

菌体密度测定利用分光光度计法，一定浓度的植物乳杆菌YX-1 发酵菌液在600 nm 下有一定的吸光度，发酵菌液菌体含量和吸光度呈正比关系，用紫外分光光度计作为检测工具，检测未知浓度菌液的OD 值，通过比较OD 值的大小就可以判断该菌液中的菌体浓度大小。所以在培养完成后，将培养液稀释合适的倍数（使得OD 值为0.2～0.8），测定其在600 nm[16]处的OD 值，每个样品重复测定3 次，计算平均值与标准偏差，即可判断该培养液中植物乳杆菌YX-1 的菌体浓度大小。

1.3.2 活菌计数

活菌计数利用稀释涂布平板法[17]，步骤如下：

（1）稀释。用移液枪移取1 mL 菌液至9 mL 无菌生理盐水中，充分振荡后得到稀释倍数为101的稀释液，再从上一稀释液中移取1 mL 菌液至9 mL 无菌生理盐水中，得到102稀释液。依次类推得到103，104，105，106，107，108稀释倍数的系列稀释菌液。

（2）平板涂布。选取适宜稀释倍数的菌液，用移液枪移取100 uL 的稀释菌液，转移至准备好的固体培养基中，用洁净无菌的涂布器将稀释菌液均匀涂布（3 组对照），再将涂布好的平板倒置于适宜培养条件下培养。

（3）菌落计数。①计数要求，计数要挑选菌落数在30～300 个的平板且菌落清晰分明，每个稀释倍数的菌落数为各平板菌落数的平均值。②计算方法，如果只有一个平板上的菌落数符合计数要求，就用该平板菌落数乘以稀释倍数，作为该样品g(mL)的活菌总数；如果2 个稀释梯度的平板菌落数都符合计数要求，则根据公式（1）计算：

式中：n——样品的活菌数；

c——符合计数要求的平板中菌落数；

X1——低稀释倍数的平板个数；

X2——高稀释倍数的平板个数；

d——低稀释倍数。

每毫升菌液活菌数N=n×10 CFU/mL，冻干后菌粉加入冻干前等量无菌生理盐水进行稀释涂布平板法计数。冻干前后存活率根据公式（2）计算：

式中：N1——冻干后每毫升菌悬液的活菌数；

N2——冻干前每毫升菌液的活菌数。

每个样品冻干后对冻干样品进行精确称重，而每个平板的样品对应100 mL 发酵液，所以冻干后每克菌粉活菌数根据公式（3）计算：

式中：N1——冻干后每毫升菌悬液的活菌数；

N3——冻干后每克菌粉活菌数；

m——每100 mL 菌液对应冻干菌粉质量。

1.4 数据分析

所有单因素试验都进行3 组平行试验并重复3 次，数据的处理及作图用Office excel 工作表完成；响应面试验设计及数据分析，采用Minitab19 与Design Expert10 软件完成。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌YX-1 生长曲线

植物乳杆菌YX-1 生长曲线见图1。

图1 植物乳杆菌YX-1 生长曲线

种子液的菌龄对微生物高密度培养的收获量有着一定的影响[18]，由图1 可知植物乳杆菌YX-1 从8 h开始进入对数期，在约22 h 时进入稳定期。因此作为种子液的最佳静止培养时间可以在18～22 h。

2.2 单因素试验

2.2.1 不同碳源种类和浓度对菌体增殖的影响

不同碳源下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度见图2。

由图2 可知，乳酸菌对单糖的利用效率更高，豆渣粉中碳源主要为纤维素不易被利用，所以菌体浓度低，以葡萄糖为碳源时OD600nm值最大，确定使用葡萄糖作为碳源进行后续试验。

图2 不同碳源下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度

不同葡萄糖质量浓度下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度见图3。

图3 不同葡萄糖质量浓度下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度

由图3 可知，当葡萄糖质量浓度为25g/L 时，菌体OD600nm最大。杨加怀[19]研究植物乳杆菌299（L.pla-ntarum 299）优化培养基中葡萄糖最佳质量分数为2.5%，陈百莹等人[20]研究植物乳杆菌ZJ316（Lactobacillus plantarum ZJ316）优化培养基中葡萄糖最佳质量分数为2%。与该试验结果相差不大。因此最适葡萄糖质量浓度为25 g/L。

2.2.2 不同氮源种类和浓度对菌体增殖的影响

不同氮源下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度见图4，不同氮源质量浓度下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度见图5。

图4 不同氮源下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度

由图4 可知，蛋白胨为氮源时OD600nm值最大，确定使用蛋白胨作为氮源进行后续试验。由图5 可知，OD600nm值随蛋白胨质量浓度升高呈现先上升后趋于平稳，当蛋白胨质量浓度为35 g/L 时，OD 值最大，确定蛋白胨的最适质量浓度为35 g/L。

图5 不同氮源质量浓度下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度

2.2.3 不同酵母粉质量浓度对菌体增殖的影响

不同酵母粉质量浓度下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度见图6。

图6 不同酵母粉质量浓度下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度

由于乳酸菌的生理结构及细胞内酶体系较为简单，许多氨基酸不能自身合成，因此为满足乳酸菌自身生长代谢需要从外界吸收氮源[21]。所以添加一种补充氮源很有必要。由图6 可知，当酵母粉质量浓度为6 g/L 时，OD 值最大，确定植物乳杆菌YX-1高密度培养酵母粉的最适质量浓度为6 g/L。

2.2.4 不同初始pH 值对菌体增殖的影响

不同初始pH 值下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度见图7。

由图7 可知，培养液OD600nm值随着初始pH 值升高呈现先上升后下降的趋势，当pH 值为8.0 时，OD600nm值最大，确定植物乳杆菌YX-1 高密度培养最适初始pH 值为8.0。

2.2.5 不同接种量对菌体增殖的影响

不同接种量下乳酸菌YX-1 培养液吸光度见图8。

图8 不同接种量下乳酸菌YX-1 培养液吸光度

接种量较低时，菌体生长繁殖空间相对较大，菌体密度较低。接种量过大，菌体在前期大量生长，产生乳酸，使pH 值迅速下降，从而抑制了菌体的生长增殖[22]。由图8 可知，接种量为1%～5%时，植物乳杆菌YX-1 的OD600nm值随接种量升高呈现先上升后下降的趋势，在接种量为3%时达到最大OD600nm值，而后随着接种量的增加其OD600nm值呈下降趋势。因此，植物乳杆菌YX-1 高密度培养的接种量为3%。

2.2.6 不同培养时间对菌体增殖的影响

不同培养时间下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度见图9。

图9 不同培养时间下植物乳杆菌YX-1 培养液吸光度

由图9 可知，12～24 h 菌体快速增殖，OD600nm在24 h 达到最大，而24 h 后菌体OD600nm快速下降菌体衰亡速度较快，所以植物乳杆菌YX-1 最佳收获期为24 h，这一结果也与生长曲线规律一致。

2.3 Plackett-burman 设计筛选对植物乳杆菌YX-1增殖有显著影响的因素

为了进一步筛选出对植物乳杆菌YX-1 菌体增殖影响最显著的因子，试验利用软件Minitab 19 选择N=12 的Plackett-Burman 设计，共考查6 个影响因素：碳源质量浓度（A）、氮源浓度（B）、酵母粉质量浓度（C）、pH 值（D），种子液接种量（E）和发酵时间（F）。每个因素取低水平和高水平，高水平浓度取低水平的1.5～2.0 倍，以培养液OD600nm值为响应值，得出试验数据后，通过软件分析各个因素的效应，选择置信度满足条件（p＜0.05）的因子作为显著因子进一步试验。

Plackett-burman 设 计 结果（N=12）见 表1，Plackett-burman 设计的各因素的系数的估计及效应评价（α=0.05，置信度95%）见表2。

表1 Plackett-burman 设计结果（N=12）

表2 Plackett-burman 设计的各因素的系数的估计及效应评价（α=0.05，置信度95%）

由表2 可知，对植物乳杆菌YX-1 增殖有显著影响（置信度＞95%）的因子有葡萄糖质量浓度、蛋白胨质量浓度和酵母粉质量浓度，这3 个因素效应值均为正值即为正效应，其中葡萄糖质量浓度正效应十分显著。由图10 可知，各种因子对植物乳杆菌YX-1 生长影响的显著程度。

标准化效应的Pareto 图见图10。

图10 标准化效应的Pareto 图

2.4 最陡爬坡试验确定中心点

根据Plackett-Burman 设计试验结果[23]，确定了著因子的正负效应，由表2 可知3 个影响显著的因素都呈现正效应，呈正效应的因素应取高水平且逐步增大，3 个因子分别设置步长：+5、+5、+3 以菌液OD600nm为响应值，确定中心点。

最陡爬坡试验设计及结果见表3。

由表3 可知，最大的OD 值出现在试验5，所以试验5 的试验条件就是响应面设计的中心点，即为葡萄糖质量浓度45 g/L，蛋白胨质量浓度55 g/L，酵母粉质量浓度18 g/L。

表3 最陡爬坡试验设计及结果

2.5 响应面设计确定最显著因素的最优水平

利用Minitab 19 软件分别以葡萄糖、蛋白胨、酵母粉3 种培养基成分的质量浓度这3 个因素作为自变量，菌液OD600nm为响应值，根据最陡爬坡试验确定的中心点，进行响应面设计选用15 组试验的Boxbehnken 试验设计。利用Design Expert 8.0 对试验结果进行二次回归分析[24]，拟合回归方程如下：

Box-behnken 试验设计及结果见表4，响应值的方差分析见表5。

表4 Box-behnken 试验设计及结果

由表5 可知，一次项C，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（p＜0.01）、交互项AC 对结果影响为显著（p＜0.05）。该回归模型的p=0.004（＜0.01），说明模型合理，可信度高；并且失拟误差p=0.404（＞0.05），失拟误差置信度低，说明模型选择恰当。模型的确定系数R2=0.964 0，校正系数R2Adj=0.899 3，说明模型的预测值与实际值契合度高，调整后的（R2）=89.93%，表明89.93%的菌体质量分数变化可以根据此模型解释。

表5 响应值的方差分析

葡萄糖质量浓度和酵母粉质量浓度的响应图及等高线图见图11，葡萄糖质量浓度和蛋白胨质量浓度的响应图及等高线图见图12，酵母粉质量浓度和蛋白胨质量浓度的响应图及等高线图见图13。

图11 葡萄糖质量浓度和酵母粉质量浓度的响应图及等高线图

图12 葡萄糖质量浓度和蛋白胨质量浓度的响应图及等高线图

图13 酵母粉质量浓度和蛋白胨质量浓度的响应图及等高线图

由响应方程可以看出，响应方程的二次项系数均为负数，所以响应图抛物面开口向下，响应方程有最大值。利用Design Expert 8.0 分析计算得出，当葡萄糖质量浓度为45.44 g/L，蛋白胨质量浓度为54.46 g/L，酵母粉质量浓度为17.37 g/L 时，最大吸光度OD600nm为11.384 4。考虑实际操作可行性，将上述最优条件修正为葡萄糖质量浓度45 g/L，蛋白胨质量浓度54 g/L，酵母粉质量浓度17 g/L。以这个最优条件进行了3 次重复试验，测得发酵液吸光度OD600nm平均值为11.953 7，与预测拟合度达到95%，表明优化模型可靠；培养液活菌计数达到3×109CFU/mL，而初始培养基的培养液活菌数为1.29×109CFU/mL，通过优化使得单位体积发酵液活菌数增大了2.325 倍。陈百莹等人[20]在对植物乳杆菌ZJ316（Lactobacillus plantarum ZJ316）的培养基配方优化中，优化后菌体数为9.28×109CFU/mL，数据与试验结果在同一数量级，说明数据可靠。

2.6 植物乳杆菌YX-1 冻干菌粉的制备

利用以上系列试验获得的最佳培养基质量浓度和培养条件，对植物乳杆菌YX-1 进行培养，将培养液分装至50 mL 离心管中，以转速6 000 r/min 离心20 min，弃去上清液，加入20 mL 无菌生理盐水振荡洗涤，相同条件下再次离心得到菌泥。将冻干保护剂和菌泥以3∶1 的比例充分混匀后得到菌悬液。将菌悬液装入洁净平板保鲜膜封口，置于-20 ℃冰箱中预冻12 h，再转移至真空冷冻干燥机中冻干24 h得到干燥菌粉。再对冻干的菌粉进行稀释涂布，对冻干后菌粉进行活菌计数，冻干菌粉活菌数达到9.74×1011CFU/g，杨加怀[19]在植物乳杆菌299（L.plantarum 299）的高密度培养及冷冻干燥保护的研究中，冻干菌粉中的活菌数为2.11×1011CFU/g，数据与试验结果在同一数量级，说明数据可靠。冻干后菌体存活率达到83.33%，复合保护剂的冻干保护效果较好。

冻干菌粉见图14。

图14 冻干菌粉

3 结论

通过单因素试验确定了单个因素的最佳条件，再通过Plackett-Burman 设计，得出对植物乳杆菌YX-1 增殖影响最显著的3 个因子分别为葡萄糖质量浓度、酵母粉质量浓度和蛋白胨质量浓度。通过响应面设计，对3 个最显著因子进行了优化，得到最显著因子的最佳条件为蛋白胨质量浓度54.46 g/L，葡萄糖质量浓度45.44 g/L，酵母粉质量浓度17.37 g/L，接种量3%，初始pH 值8.0，培养时间24 h。经过试验验证，在最终优化后的培养条件下，培养液活菌计数达到3×109CFU/mL，而初始培养基的培养液活菌数为1.29×109CFU/mL，通过优化使得单位体积发酵液活菌数增大了2.325 倍。所以通过响应面优化得到植物乳杆菌YX-1 最优培养基是合理且可行的。试验还选择了一个复合保护剂配方：奶粉质量浓度15 g/L，蔗糖质量浓度20 g/L，糊精质量浓度25 g/L，甘油含量3 mL/L 制备冻干菌粉，经过计数冻干菌粉活菌数达到9.74×1011CFU/g，相较于冻干前存活率为83.33%，保护效果良好。该试验仅使用单一配方制备了冻干菌粉，还可以设计试验探究保护剂的最佳配方，以得到最佳的保护剂配方，进一步提高存活。