番石榴多酚提取及其抗氧化作用与抑制α -葡萄糖苷酶活性研究

徐金瑞，侯方丽，胡 勇，黄建蓉

（广东药科大学食品科学学院，广东中山 528458）

生物体内自由基过量堆积引发的氧化损伤，是导致生物衰老及诱发Ⅱ型糖尿病等相关代谢性疾病发生的主要原因之一。如果给予适当自由基清除剂及时清除体内多余的自由基，可以减少细胞的氧化损伤，从而预防或防止这些重大疾病的发生发展[1-3]。科学研究证实，植物组织内许多活性物质具有较好的抗氧化作用。α -葡萄糖苷酶可促进肠道食物中碳水化合物（如淀粉、蔗糖、麦芽糖等）分解成单糖，引起餐后血糖升高，如果α -葡萄糖苷酶活性被抑制或降低，可减缓葡萄糖的生成吸收，在一定程度上降低餐后血糖值。因此，临床上常通过对α -葡萄糖苷酶活性抑制作用的检测，初步判断药物有无降糖活性[4]。

番石榴是华南地区较为畅销的水果之一，果实清甜可口，维生素、果糖、葡萄糖、谷氨酸、膳食纤维，以及钙、磷、铁等人体所需的微量元素含量丰富，是各种果蔬之冠，常吃番石榴具有抗衰老、调节生理机能、治疗糖尿病、抗病毒、抗辐射等功效[5]。目前，有关番石榴果实的功效评价还较少，且多集中在化学成分方面的研究[6-9]。利用超声波提取活性物质的过程中，由于物料受到超声波的冲击，再加上超声波的空化作用，使得流体的相接触面大大增加，从而强化了传质过程。另外，超声波被介质吸收后，转化为热能，进一步使得物料内部温度升高，加速了多酚等有效成分的溶解，故而已在很多研究中被应用。

基于此，拟采用超声波辅助萃取法优化番石榴中多酚物质的提取工艺，并对其体外清除自由基（DPPH·）和抑制α -葡萄糖苷酶的能力进行评价，可为番石榴及其产品的开发提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

（1）材料。番石榴洗净、切片，于50 ℃下烘干，粉碎，过40 目筛，备用。

（2）主要试剂。三吡啶三吖嗪（TPTZ），Fluka公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Sigma 公司提供；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）和α -葡萄糖苷酶（1KU），北京索莱宝科技有限公司提供。

1.2 仪器设备

pHS-3C 型酸度计，上海精密科学仪器股份有限公司产品；V-1200 型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；RE-2000 型旋转浓缩蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；FD-1E-80 型冷冻干燥机，上海楚定分析仪器有限公司产品；DFY-500 型高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司产品；SB25-12DT 型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 多酚含量的测定-酒石酸亚铁比色法[10]

吸取1 mL 待测样液于25 mL 比色管中，加入4 mL 蒸馏水和5 mL 酒石酸亚铁溶液，混合后，用pH 值7.5 磷酸盐缓冲液定容，混匀；同时以蒸馏水代替样品提取液作空白，于波长540 nm 处测定吸光度。另以0～50 μg/mL 的焦性没食子酸标准溶液代替样液制作标准曲线，得到回归方程Y=2.669X-0.008 9，R2=0.999 5。

1.3.2 总抗氧化能力（TAC）测定[11]

实际加样量扩大20 倍，即0.2 mL 样品+0.6 mL水+6 mL 37 ℃的FRAP 工作液（10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3、0.3 mmol/L 醋酸钠缓冲液以1∶1∶10 的质量比混合），摇匀后放置4 min，于波长593 nm处测定吸光度。另以0.1～1.0 mmol/L FeSO4标准溶液代替样品作标准曲线，得到回归方程Y=0.311 7X-0.006，R2=0.999 4。样品的总抗氧化能力以FeSO4提取物表示，单位mmol/g。

1.3.3 番石榴多酚提取工艺优化

（1）单因素试验。①料液比的选择，取1 g 样品4 份，设置超声波温度50 ℃，提取时间20 min，60%乙醇作为溶剂，考查料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL）对多酚含量和总抗氧化能力的影响。②乙醇体积分数的选择，取1 g 样品5 份，设置超声波温度50 ℃，提取时间20 min，料液比1∶40（g∶mL），考查乙醇体积分数40%，50%，60%，70%，80%对多酚含量和总抗氧化能力的影响。③超声温度的选择，取1 g 样品4 份，按料液比1∶40（g∶mL）加入70%乙醇溶液，提取时间20 min，考查温度40，50，60，70 ℃对多酚含量和总抗氧化能力的影响。④提取时间的选择，取1 g 样品4 份，设置超声波温度50 ℃，按料液比1∶40（g∶mL）加入70%乙醇溶液，考查提取时间10，20，30，40 min 对多酚含量和总抗氧化能力的影响。

（2）正交试验设计。在单因素试验的基础上，以多酚含量为考查指标，料液比、乙醇体积分数、温度和超声波作用时间等4 个因素作为自变量进行L9（34）正交试验设计。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3.4 番石榴多酚的制备

根据正交试验优化方案，设置超声温度为50 ℃，按料液比1∶50（g∶mL）将适量番石榴粉加入60%乙醇溶液中，提取30 min，收集滤液，浓缩、冷冻、干燥，用于1.3.5 和1.3.6 试验。

1.3.5 清除DPPH·的能力[12]

用无水乙醇作参比空白液，于0.2 mmol/L DPPH·溶液2 mL 中加入0～100mg/L 样品2 mL，摇匀于室温下放置30 min，于波长517 nm 处测定其吸光度A1，同时测2 mL 样品与2 mL 无水乙醇反应后的吸光度A2，再测定0.2 mmol/L 的DPPH·溶液2 mL与无水乙醇2 mL 反应后的吸光度A3。根据以下公式计算样品对DPPH·的抑制率：

式中：A1——DPPH·溶液与样品溶液反应后的吸光度；

A2——样品溶液与空白溶剂反应后的吸光度；

A3——DPPH·溶液与空白溶剂反应后的吸光度。

1.3.6 α -葡萄糖苷酶抑制试验[13]

以0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 值6.8）为溶剂，分别配制1.0 U/mL α -葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L PNPG 溶液。将1.0 U/mL α -葡萄糖苷酶600 μL、pH 值6.8 磷酸钠缓冲液200 μL，不同质量浓度（20～100 mg/L）番石榴多酚溶液200 μL 混匀后，于37 ℃下保持10 min，加入1.0 mmol/L PNPG 溶液200 μL，混匀后于37 ℃下保温30 min，再加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2 mL 终止反应，于波长400 nm 处测定浓度梯度番石榴多酚作用下的吸光度。

式中：A1——加番石榴多酚抑制剂和α -葡萄糖苷酶反应后的吸光度；

A2——只加番石榴多酚抑制剂不加α -葡萄糖苷酶的吸光度；

A3——不加番石榴多酚抑制剂只加α -葡萄糖苷酶反应后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 番石榴多酚提取单因素试验

2.1.1 料液比对提取效果的影响

料液比对提取效果的影响见图1。

图1 料液比对提取效果的影响

从图1 可以看出，随着料液比逐渐加大，多酚含量和总抗氧化能力逐渐增大，且变化趋势基本一致，推测番石榴多酚可能是其抗氧化的物质基础之一。当料液比增至1∶40 后，多酚含量和总抗氧化能力增量趋于平缓，从成本考虑，料液比选择1∶40比较适宜。

2.1.2 乙醇体积分数对提取效果的影响

乙醇体积分数对提取效果的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对提取效果的影响

从图2 可以看出，随着乙醇体积分数的增高，番石榴多酚含量和总抗氧化能力均表现出增大的趋势，当乙醇体积分数增至70%时达到峰值，之后多酚含量和总抗氧化能力都相应下降，特别是总抗氧化能力下降趋势明显。可能是随着乙醇体积分数的逐渐增高，提取体系的极性降低，此时番石榴中一些极性较小的成分也竞相溶出，加上溶剂化及其热效应的共同作用，造成多酚含量及其抗氧化能力降低。

通过对识字教学方式的对比，可以影射出教学方法背后教学目的的差异。教材编写目标是不断嬗变的。人教版语文教材的编写理念依据课程标准（2001年版），“在语文学习过程中，培养爱国主义感情、社会主义道德品质，逐步形成积极的人生态度和正确的价值观，提高文化品位和审美情趣”。[1]因此多通过传统人文经典、祖国壮美山河、科技重大进步等话题编排识字材料，通过此类话题分支下的教学达到识字与培育民族向心力的双重目的。

2.1.3 超声温度对提取效果的影响

超声温度对提取效果的影响见图3。

图3 超声温度对提取效果的影响

从图3 可以看出，随着提取温度的逐步升高，多酚含量和总抗氧化能力开始增大，但温度升至50 ℃后，多酚含量和总抗氧化能力均呈下降趋势，可能是温度过高造成多酚类物质被破坏，同时较高浓度时乙醇溶液部分挥发所致。

2.1.4 提取时间对提取效果的影响

提取时间对提取效果的影响见图4。

图4 提取时间对提取效果的影响

从图4 可以看出，在最初一段时间，随着超声波作用时间的不断延长，多酚含量及抗氧化能力均表现出增大的趋势，当超过30 min 后，多酚含量和总抗氧化能力的增量均趋于平缓，从节约能耗角度考虑，提取时间30 min 左右较为适宜。以往文献资料中对活性物质采用常规方法提取时间较长，说明超声波具有在短时间内明显加速多酚类有效成分溶出的作用。

综合上述研究结果可以发现，番石榴中多酚含量和总抗氧化能力变化趋势一致，为了简化研究，后续正交试验中仅以多酚含量作为考查指标。

2.2 正交设计试验

以多酚含量为考查指标，根据单因素试验结果，对料液比、乙醇体积分数、超声温度和超声时间等4 个因素按照L9（34）进行正交试验。

表2 正交试验设计及结果

根据表2 可优化得到超声提取番石榴多酚的最佳因素水平组合为A2B2C2D3，即料液比1∶50，乙醇体积分数60%，提取温度50℃，超声时间30 min。通过比较极差值，各因素对提取效果的影响主次顺序为C＞D＞B＞A，说明提取温度对多酚提取的影响最大，其次分别是超声时间，乙醇体积分数和料液比。由于最佳试验组合并没有出现在试验方案中，进一步对最佳提取条件进行了验证，测得的多酚含量为53.54 mg/g，均高于9 组方案的试验结果，说明正交试验所得最优条件合理可行。

2.3 对DPPH·的清除效果

番石榴多酚清除DPPH·的能力见图5。

图5 番石榴多酚清除DPPH·的能力

从图5 可以看出，在0～100 mg/L 质量浓度范围内，番石榴多酚提取物对DPPH·的清除能力逐渐增强，通过线性拟合得到回归方程Y=0.875 8X+3.686 4，R2=0.979 2，将Y=50 代入可计算出IC50=52.88 mg/L。对比前期研究[10]得到的抗坏血酸IC50=46.76 mg/L，番石榴多酚清除DPPH·的能力稍弱于抗坏血酸，这可能与多酚纯度较低有关，还需进一步纯化后再做比较，但这一结果同时也说明了番石榴多酚清除自由基的能力较强，可以作为抗氧化活性资源来利用。

2.4 对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

番石榴多酚对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用见图6。

图6 番石榴多酚对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用

从图6 可以看出，在0～10 mg/mL 质量浓度范围内，番石榴多酚提取物对α -葡萄糖苷酶活性的抑制作用随着浓度增大逐渐增强，当质量浓度增大至8 mg/mL 后，抑制作用趋于平缓。通过线性拟合得到回归方程Y=6.812 6X+2.5，R2=0.970 9，将Y=50 代入可计算出IC50=6.97 mg/mL。张钟等人[14]在荔枝多糖抑制α -葡萄糖苷酶活性的研究中发现，40 mg/mL的阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为69.23%。根据研究得到的回归方程，可计算出同样抑制率时番石榴多酚质量浓度仅为9.80 mg/mL，说明番石榴多酚对α -葡萄糖苷酶活性具有很强的抑制作用，可以作为α -葡萄糖苷酶抑制剂来开发。

3 结论

番石榴多酚的最佳提取工艺为料液比1∶50，乙醇体积分数60%，温度50 ℃，超声时间30 min。抗氧化和抑制α -葡萄糖苷酶活性试验表明，番石榴多酚具有较强的清除DPPH·能力和抑制α -葡萄糖苷酶活性作用，说明番石榴多酚具有较强抗氧化作用，且是良好的α -葡萄糖苷酶抑制剂，表明番石榴多酚可作为抗氧化与降血糖功效因子加以开发利用。