血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞亚群检测的临床意义

陆 洛，王 飞，顾伟英

(苏州大学附属第三医院，常州市第一人民医院 血液科，江苏 常州 213000)

血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)是外周T细胞淋巴瘤(PTCL)的一种亚型，占PTCL的15%～20%[1]，其发病率具有明显的地域差异。2012年我国一项多中心研究报道的AITL占PTCL 12.44%[2]，比例略低于国外报道(美国16%，亚洲18%，欧洲29%)[3]。尽管AITL发病率低，但却进展快、侵袭性高、死亡率及复发率高，预后较差。其肿瘤起源于生发中心滤泡辅助T细胞(TFH)，AITL 具有独特的肿瘤微环境，表现为少数恶性 TFH 细胞与多种多谱系免疫细胞混合，是一类具有特殊病理形态、免疫表型及生物学行为的侵袭性淋巴瘤，并且与自身免疫异常有着密切的关系[4]，常表现为以免疫失调和免疫缺陷为特征的临床综合征，首发症状多表现为全身淋巴结肿大，可伴随出现B症状、肝脾大、骨髓浸润，部分患者可出现皮疹、胸腔和腹腔积液、关节痛、关节炎等。既往研究表明，患者免疫系统发挥重要的抗癌作用，其功能障碍促使疾病发生与进展[5]。在一些类型的淋巴瘤中，淋巴细胞减少可作为预后不良的标志。自体和同种异体干细胞移植后淋巴细胞的早期恢复是淋巴瘤控制和患者生存的重要预测指标[6]。但是关于AITL的研究较少，基于AITL的免疫特色，我们回顾性收集了苏州大学附属第三医院收治的初诊AITL患者的临床资料，分析其临床特征和影响预后的因素，并试图探讨患者诊断时外周血淋巴细胞免疫功能状态、治疗过程中的免疫反应及其临床意义。

1 资料与方法

1.1研究对象 回顾性收集2016年3月至2021年9月就诊于苏州大学附属第三医院(常州市第一人民医院)的16例初诊AITL患者的资料，所有患者均在本院行病理学检查，依据2008年世界卫生组织(WHO)淋巴造血组织肿瘤分型标准确诊，且在本院接受后续治疗。并收集了10例健康人群的淋巴细胞亚群结果为对照组，其中男性7例，女性3例，中位年龄32岁(20～55岁)。本研究经常州市第一人民医院伦理委员会审核批准(2022科第155号)，患者及对照组均知情同意并签署知情同意书。

1.2治疗方法 16例患者一线治疗方案如下，接受CHOP方案化疗(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)10例(62.50%)，接受CHOPE方案化疗(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、依托泊苷)3例(18.75%)，接受CHOP+西达苯胺方案化疗2例(12.50%)，接受CHOP+西达苯胺+阿扎胞苷方案化疗1例(6.25%)。

1.3资料收集及随访 收集患者基本资料及相关实验室、影像学检查结果，实验室检查如血常规、血清乳酸脱氢酶(LDH)、血清β2微球蛋白(β2-MG)、血清白蛋白、骨髓穿刺及活检、免疫球蛋白及轻链、淋巴细胞亚群等指标。临床分期依照Ann Arbor分期系统，体能状态按东部肿瘤协作组(ECOG)评分标准分为1～5 级，并采用国际预后指数(IPI)、外周T细胞淋巴瘤非特指型预后指数(PIT)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤预后指数(PIAI)对本组患者进行评分[7]。通过门诊或电话进行随访，随访截止时间为2022年4月30日。无进展生存时间(PFS)定义为从诊断时至第一次疾病进展死亡随访截止的时间。总生存时间(OS)定义为从诊断时至任何原因导致的死亡或随访截止的时间。

1.4外周血CD4/CD8比值临界值设定 将CD4/CD8比值作为检验变量，以患者的OS状态为状态变量，定义事件为存活，绘制ROC曲线，计算临界值。通过SPSS软件计算得到曲线下面积(AUC)为0.906(95%CI0.762～1.000)，根据约登指数公式确定最佳临界值为1.140。此时约登指数为0.630，敏感度为0.630，特异度为1.000。将CD4/CD8比值作为检验变量，以患者的PFS状态为状态变量，定义事件为进展，绘制ROC曲线，计算临界值。通过SPSS软件计算得到AUC为0.825(95%CI0.621～1.000)，根据约登指数公式确定最佳临界值为1.140。此时约登指数为0.560，敏感度为0.560，特异度为1.000。最终选择CD4/CD8临界值为1.140，根据该值将病例分为高CD4/CD8组与低CD4/CD8组。

1.5统计学方法 采用SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0进行统计学分析。采用Kaplan-Meier法及COX回归模型进行生存分析，采用Log-Rank检验进行组间率的比较，计数资料采用Pearson卡方检验及Fisher精确概率，计量资料采用非参数检验。均进行双尾检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1患者一般临床特征 16例患者的中位年龄为71岁(53～83岁)，其中男性10例(62.50%)，女性6例(37.50%)。12例(75.00%)患者发病时有B症状。Ann Arbor分期为Ⅳ期者12例(75.00%)，Ⅲ期者3例(18.75%)，Ⅱ期者1例(6.25%)。9例患者(56.25%)合并有结外病变，其中合并鼻咽部受累者4例，皮肤受累3例，肺受累2例，肾脏受累1例，存在浆膜腔积液9例(56.25%)，骨髓受累2例(12.50%)。IPI评分3～5分者11例(68.75%)，PIT评分2～4分者12例(75.00%)，PIAI评分2～5分者14例(87.50%)。以CD4/CD8=1.140为临界值，根据该值将病例分为高CD4/CD8组(5例)与低CD4/CD8组(11例)。两组在年龄、实验室检查、分期、风险评分等基线特征方面差异无统计学意义(P>0.05)，提示两组基线匹配良好，指标之间有可比性，见表1。

表1 两组基本临床特征比较(例)

2.2初诊AITL患者淋巴细胞亚群特征 和对照组相比，在外周血T细胞亚群中，患者初诊时CD3+T细胞、CD4+T细胞计数及CD4/CD8比值明显降低(P=0.007，P=0.003，P=0.031)，CD3+CD69+早期活化T细胞计数升高(P=0.014)，CD3+CD25+活化T细胞计数则明显较低(P=0.006)。而B细胞亚群中，患者初诊时CD19+B细胞、CD20+B细胞、CD5+CD19+及CD19+CD23+活化B细胞计数皆明显低于正常对照(P<0.01，P<0.01，P=0.003，P=0.002)，尽管CD3-HLA-DR+B细胞计数较对照组高(P=0.003)，见图1。

图1 AITL患者诊断时与健康人群淋巴细胞亚群计数的比较 a、b分别为T细胞淋巴亚群及B细胞淋巴亚群

2.3治疗后AITL患者淋巴细胞亚群的变化 动态监测患者T细胞亚群，发现化疗第1疗程后，患者CD3+T细胞比例较诊断时明显升高(P=0.040)，而3个疗程后患者CD3+细胞比例回落，虽差异无统计学意义，但仍高于初诊时。第1疗程后CD4+T细胞比例、CD3+CD25+活化T细胞比例及CD4/CD8比值无明显变化，而3个疗程后，皆明显高于初诊时(P=0.017，P=0.045，P=0.017)。CD8+T细胞比例在第1疗程后稍有升高，而3疗程后明显下降(P=0.015)，见图2。

图2 AITL患者治疗前后淋巴细胞亚群的动态变化

2.4生存分析结果 单因素分析结果显示ECOG评分高、PIT评分高、PIAI评分高、β2微球蛋白高、血清白蛋白低、Kappa链高、Lambda链高、CD4/CD8高与更差的PFS相关，而有浆膜腔积液、ECOG评分高、PIAI评分高、免疫球蛋白G(IgG)高、Lambda链高、CD4/CD8高与更差的OS相关(表2)。而纳入多因素分析后，未见差异有统计学意义。16例患者中位随访时间474 d(20～1 760 d)，4例患者在疗效评估前因疾病进展死亡，可评估的12例患者中，患者中期评估疾病进展(PD)1例，部分缓解(PR)9例，完全缓解(CR)2例。在随后的治疗中，死亡4例，终期可评估的患者8例，PD 1例，CR7例。中位PFS为194 d，中位OS为400 d。Kaplan-Meier分析显示低CD4/CD8组PFS(未达到 vs 116 d，P=0.012)及OS(未达到 vs 116 d，P=0.002)均明显优于高CD4/CD8组，见图3。患者的2年PFS率(63.60% vs 0)和2年OS率(72.70% vs 0)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 CD4/CD8比值对患者PFS及OS的影响

表2 影响AITL患者预后的单因素分析

3 讨 论

AITL是PTCL中的第2种常见亚型，但仅占所有非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的1%～2%[3]。根据美国国家癌症研究所监测、流行病学和最终结果数据库(SEER 数据库)的大型人群研究报告数据，AITL诊断时的中位年龄为69岁，男性的发病率略高(51.50%)，80%的患者初诊时即表现为晚期(Ⅲ～Ⅳ期)[8]。目前AITL 的一线治疗方案仍以CHOP或CHOP样方案为首选，尽管缓解率可以达到50%～70%，但其长期生存较差，5年OS率仅为30%～40%[9-11]。我们分析的16例患者基本特征与既往报道数据相似，中位年龄71岁，男性占62.50%，75.00%患者发病时有B症状，56.25%合并结外病变，93.75% Ann Arbor分期为Ⅲ期及Ⅳ期，且大部分患者预后评分为高危。一线予CHOP或CHOP样方案化疗后，客观缓解率(ORR)43.75%，2年PFS率31.30%，2年OS率40.00%。因AITL发病率低，大样本的病例报道及临床研究均较为少见，至今仍缺乏明确公认的预后指标，本研究结果显示ECOG评分高、PIT评分高、PIAI评分高、β2微球蛋白高、血清白蛋白低、Kappa链高、Lambda链高、CD4/CD8高的患者PFS更差，而有浆膜腔积液、ECOG评分高、PIAI评分高、IgG高、Lambda链高、CD4/CD8高的患者OS更差，与既往报道相符[9, 12]，但这些指标对AITL生存的评估价值还有待更多大样本的临床研究证实。

AITL是以严重炎性反应和免疫反应为特征的侵袭性淋巴瘤，肿瘤组织破坏淋巴组织的结构和功能，而淋巴细胞的功能异常又导致机体免疫功能受损，免疫功能缺陷又进一步促进肿瘤的生长。因此通过分析患者淋巴细胞亚群，明确患者的免疫状态，可为患者的临床预后分析及免疫治疗提供一定的思路。CD3为T细胞特有的标志，根据功能不同分为辅助/诱导T淋巴细胞(CD4+)，抑制/细胞毒 T淋巴细胞(CD8+)和调节性T淋巴细胞(Treg细胞)。辅助T细胞通过分泌各种细胞因子、辅助诱导激活细胞毒T细胞发挥抗肿瘤作用；而细胞毒T细胞通过介导细胞免疫应答控制肿瘤生长。B细胞主要参与体液免疫，产生抗原特异性抗体。NK细胞则发挥非特异性细胞毒性效应。生理状态下，各亚群之间的数量和功能处于平衡状态，维持机体的免疫功能稳定。最近的研究发现，CD4+T淋巴细胞的计数减低在弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤中为不良预后因素[13-15]，在多发性骨髓瘤中亦然[16]，而Treg细胞比例升高预示着弥漫大B细胞淋巴瘤预后不佳[17]。也有证据表明，NK 细胞在慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征中具有强大的抗肿瘤活性[18]。本研究中，AITL患者外周血中CD3+T细胞及CD4+T细胞计数、CD4/CD8比值较健康对照组明显降低，CD8+T细胞计数与健康对照间差异无统计学意义，CD3+CD69+活化T细胞计数较对照组高，而CD3+CD25+活化T细胞计数明显较低。CD3+、CD4+T细胞计数及CD4/CD8比例的降低，提示参与细胞免疫的淋巴细胞减少且比例异常，这可能导致机体特异性免疫应答被削弱。CD69是T细胞活化后上调的最早标志物之一，它在静止的淋巴细胞中以非常低的基础水平表达，CD25是白介素-2(IL-2)受体的α链，在外周血调节性和静息记忆T细胞表面呈组成性表达，可使得T淋巴细胞活化并进一步产生IL-2。可以推测，虽然AITL患者能启动初始T细胞活化，但随后进一步活化受限。另一方面，虽然CD3-HLA-DR+B细胞计数升高，但CD19+B细胞、CD20+B细胞、CD5+CD19+活化B细胞及CD19+CD23+活化B细胞计数皆明显低于健康对照组。这些表明患者整体体液免疫功能也将受到抑制。最终将导致机体对恶性细胞免疫反应减弱，从而降低机体清除恶性细胞的能力，使淋巴瘤细胞持续生长。但受限于回顾性研究，我们目前无法明确其可能的机制，有赖于后续研究进一步探索。既往有研究发现NK细胞及Treg细胞与淋巴瘤的发生、发展有着密切联系[19-21]，但本研究中NK细胞、Treg细胞比例与健康对照组间差异无统计学意义，这可能与回顾性研究样本量小有关。对治疗过程中患者T细胞亚群的动态监测发现，化疗第1疗程后，CD3+T细胞比例较诊断时明显升高，CD8+T细胞比例稍有升高，说明化疗后外周血中成熟T淋巴细胞比例增加。3个疗程后患者CD4+T细胞比例、CD3+CD25+活化T细胞比例及CD4/CD8比值皆明显高于初诊时，CD8+T细胞比例则明显下降，这提示联合化疗可能使患者免疫功能部分恢复，尚需进一步开展研究，分层分析不同疾病状态、不同治疗反应患者间免疫紊乱的程度，更深入地探索药物对免疫功能的影响，为指导治疗提供新思路。

鉴于单因素分析显示CD4/CD8比值高与更差的PFS、OS相关，我们将患者分为高CD4/CD8组与低CD4/CD8组，生存分析显示低CD4/CD8组PFS及OS均明显优于高CD4/CD8组。CD4+T细胞通过分泌各种细胞因子如IL-2以及辅助诱导激活CD8+T细胞发挥其抗肿瘤作用，CD8+T细胞在靶细胞上发挥细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用反过来又对CD4+细胞具有调节抑制作用。因此，推测对于高CD4/CD8比例的AITL患者，其免疫细胞以辅助T细胞为主，发挥ADCC作用的细胞毒T细胞可能较低CD4/CD8组不足，最终导致机体对肿瘤细胞的免疫反应低下，清除能力减弱。这提醒我们对于CD4/CD8比值高的患者是否应采用更强烈的方案化疗，或者加入新型治疗药物提高患者免疫应答。沙利度胺具有抗血管生成和免疫调节的作用，既往报道包含该药物的GDPT方案(吉西他滨，顺铂，泼尼松和沙利度胺)可明显改善PTCL患者的PFS 和OS[22]。另一项以免疫调节剂来那度胺治疗复发难治AITL的Ⅱ期多中心单臂临床试验，共入组26例，达到CR4例(15%)，ORR为31%[23]。由此看来，研究AITL的免疫功能可为进一步研究免疫调节药物、细胞免疫治疗提供一定的依据。

外周血淋巴细胞亚群作为较简单易得的指标，对了解AITL患者免疫状态、评估预后、指导治疗有一定的意义。本研究资料为单中心回顾性研究，样本量较小，无法对不同治疗方案对AITL的预后影响进行详细的分析讨论，且随访时间短，可能造成统计结果的偏倚，进一步的结果仍需进行大样本、前瞻性、多中心的临床研究以提供循证医学依据。