鸡链球菌特异性产物与毒力基因的研究

赵洪君

（桓仁满族自治县农业发展服务中心，辽宁 桓仁 117200）

鸡链球菌病近年来已成为家禽养殖业面临的重要禽传染性疾病。研究表明，感染禽类的链球菌主要包括革兰氏血清群C群兽疫链球菌、D群粪链球菌、类粪链球菌、坚忍链球菌和鸟链球菌。感染家禽往往出现以急性死亡、冠及肉髯苍白、羽毛粗乱、腹泻、瘫痪、产蛋率下降、蛋滞留等为主要临床特征的疾病。剖检主要表现为肝脏的病理变化，如肝脏肿大、变脆，表面出现出血点，同时可见脾脏肿大，脑膜出血，也有资料显示会出现腹膜炎、输卵管炎、心内膜炎、败血症和乳腺炎等病变。鸡链球菌病在世界各地均有发生。

鸡链球菌导致鸡群发病，按照病情可分为急性型和慢性型。最近有研究发现，大多数急性链球菌病临床几乎没有前兆症状，会突然发生败血症而导致雏鸡群病死率迅速升高，剖检结果显示严重的败血症病变，出现纤维素性心包炎、脑膜炎、脾多病灶性的纤维素样坏死，肝炎、骨软骨炎、肌炎、气囊炎。患鸡出现水肿，主要存在于皮下、浆膜及肌肉，并且伴有黄色胶冻样渗出物；心包及腹腔内有渗出物，其呈现为浆液性、出血性或浆液纤维素性；肌肉有出血现象；肝脏呈暗紫色并且肿大，有时可见出血点、坏死点和肝周炎；脾脏呈圆球状肿大，有时可见出血和坏死点；肺脏瘀血或水肿；气管和支气管表面有黏性分泌物，个别患鸡喉头有坏死灶，为干酪样粟粒大小；肾脏肿大。也有患禽出现气囊炎；产蛋鸡出现卵黄性腹膜炎及卡他性肠炎，个别病例会出现腺胃黏膜出血，胃乳头有脓性分泌物，肌胃角质糜烂。慢性型主要发生关节炎、腱鞘炎，蛋鸡输卵管炎、卵黄性腹膜炎，以及心肌、肝脏、脾脏等实质器官发生炎症变性或梗死[1]。鸡链球菌可以感染各种禽类及鸟类，通过粪便检测发现养殖的火鸡群中链球菌的检出率达到100%，涉及到多个链球菌亚型，而且链球菌可以在家禽和鸟类间传播[2]。

国内禽类感染的链球菌主要是C群兽疫链球菌和D群粪链球菌。研究人员通过对河南省不同地区发病鸡群13个链球菌分离株进行生化分群试验，发现鸡链球菌病的病原主要是C群兽疫链球菌和D群粪链球菌[3]。

1 链球菌的特异性产物

1.1 黏附素

链球菌产生大量表面蛋白，能结合多种宿主胞外基质蛋白（纤连蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、玻连蛋白、层黏连蛋白、核心蛋白聚糖以及含有硫酸肝素的蛋白多糖），这些黏附素被称为MSCRAMM（识别黏附基质分子的微生物表面成分）。一些MSCRAMM，特别是结合纤维蛋白原的M蛋白，使链球菌细胞具有抗吞噬活性，其包被宿主蛋白以及可调理外源颗粒的血清蛋白识别（胶原样凝集素）的蛋白，使链球菌细胞的补体活化位点被掩盖（因此调理作用降低），从而使链球菌能避免被机体免疫系统识别吞噬。这类蛋白包括无乳链球菌的FbsA蛋白、G型类马停乳链球菌亚种的FOG蛋白、马链球菌兽疫亚种的Szp蛋白、化脓链球菌的透明质酸荚膜、无乳链球菌的BibA蛋白等。

其他黏附素负责链球菌结合到宿主细胞。如F蛋白和其他蛋白质（如Fnb和SFS）结合纤连蛋白，与细菌黏附和内化相关。肺炎链球菌、马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种的PsaA（肺球菌表面黏附素）脂蛋白主要负责黏附上、下呼吸道内壁的细胞。已经有研究表明呼吸道内皮细胞的细胞结合蛋白E-cadherin是PsaA的一个受体。

1.2 荚膜

多糖荚膜是新生隐球菌最主要的毒性因子，与新生隐球菌逃避宿主免疫密切相关。某些链球菌产生荚膜，如常见感染鸡的C群链球菌就产生荚膜。A群和C群链球菌荚膜具有相似性，均由透明质酸组成，透明质酸也是哺乳动物结缔组织的构成成分，抗原性差，不容易结合补体成分，可保护链球菌抵抗巨噬细胞的杀伤作用和补体介导的吞噬作用。敲除链球菌基因可导致菌体荚膜变小，最适生长温度也发生了变化，可见鸡链球菌荚膜与其致病性和毒性紧密相关。但B、E和G群链球菌的荚膜不是透明质酸，而是多聚糖，但这类链球菌在鸡链球菌中较少见。对于链球菌荚膜的研究多见于肺炎链球菌和猪链球菌，鸡链球菌极少，需要进一步深入研究。

1.3 细胞壁

鸡链球菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁与其他革兰氏阳性菌相似，也含有蛋白质和多糖。研究发现革兰氏阳性菌细胞壁蛋白质的结构域数量也不是很多，其中出现次数不小于2次的结构域只有高度保守的N端亲水性结构域和调控铁元素表面蛋白的特异性保守结构域[4]。N端亲水性结构域对蛋白质的翻译和定位起着重要作用。革兰氏阳性细菌中摄取血红素的最佳系统是lsd系统，在lsd系统中细胞壁作为受体将与血红素结合，在细胞壁中发挥主要作用的就是调控铁元素表面蛋白的特异性保守结构域[5]。革兰氏阳性菌细胞壁的脂磷壁酸和肽聚糖与巨噬细胞相互作用，导致释放促炎细胞因子。

1.4 化脓链球菌毒素超抗原

常见的超抗原同时结合MHCⅡ类分子和带有特定V-β区的T细胞受体分子，这种结合导致抗原递呈细胞和T细胞活化，随之全系统释放高水平的细胞因子。链球菌感染所引发的部分系统性症状来自毒素引发的大规模的T细胞的活化，最清楚的是化脓性链球菌（A群链球菌）产生的化脓链球菌毒素超抗原（Superantigen，SPE）引发的T细胞活化。化脓性链球菌产生若干种SPE：SPEA、SPEC、SPEG、SPEH、SPEI、SPEJ、SPEK、SPEL、SPEM、SSA和链球菌有丝分裂源外毒素Z（SMEZ），除了SMEZ、SPEG和SPEJ之外，其余的都位于可移动的DNA元件，化脓性链球菌各分离株通常均携带SMEZ、SPEG和SPEJ的基因，可与其他SPE基因发生多种组合。已表明马链球菌马亚种能产生SPE，包括SeeI、SeeL和SeeM，这些都可以刺激马外周血单核细胞增殖。这些SPE是前噬菌体编码的，在马链球菌兽疫亚种中已经鉴定出3种SPE：SzeF、SzeN和SzeP，已表明也能刺激马外周血单核细胞增殖，产生α肿瘤坏死因子（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）。

1.5 溶血毒素

链球菌产生大量潜在毒力因子蛋白，链球菌溶血毒素就是其中之一。链球菌溶血毒素是A群链球菌产生的一种外毒素，根据其在有氧条件下的稳定性分为氧-不稳定型（O）和氧-稳定型（S）溶血素，它们还原细胞裂解素，可裂解嗜中性粒细胞、巨噬细胞和血小板。溶血素S是导致β溶血绵羊血琼脂平板大范围β-溶血的原因。溶血素S溶细胞谱广，包括红细胞膜、白细胞膜、血小板、组织培养细胞和亚细胞器，如溶酶体和线粒体。而溶血素O包括氧不稳定且硫醇激活的溶血素、链球菌溶血素O与猪链球菌溶血素O，溶血素O常结合靶细胞膜内胆固醇，在靶细胞膜上或者膜内发生寡聚作用，形成疏水性蛋白复合物，与亲水性通道在膜内整合，形成较大的孔径（达到30 nm），从而破坏机体正常细胞。

1.6 链激酶

链激酶（Streptokinase，SK）是由A、C、G群链球菌中溶血性链球菌分泌的一种异质性纤溶酶原（Plasminogen，Pg）激活蛋白，属于胞外非酶蛋白质，是由三个结构域组成的毒力因子：SKα/SKβ/SKγ，其作用于宿主蛋白，包括纤维蛋白，能减少血栓。链激酶不能直接使纤溶酶原激活，而是和Pg形成等分子复合物，使纤溶酶原发生构象改变，从而暴露出活性部位。该活性部位催化纤溶酶原转变为纤溶酶（plasmin，Pm），从而溶解血栓。研究发现SK的1~59个氨基酸残基通过非蛋白水解机制调节其在结合的Pg中诱导活性位点的能力，并以非纤维蛋白依赖性的方式激活底物Pg[6]。研究SK的a区域的作用时发现，SK的该区域能激活Pg中的谷氨酸（glutamic acid，Glu）、赖氨酸（lysine，Lys）及Pm的Lys荧光素标记，进一步揭示了SK的分子机制[7]。

2 毒力基因的调控

目前研究发现，至少有三个系统调节化脓性链球菌毒力相关基因的表达：第一个是未知的“生长阶段相关信号”，但某些基因在静止期上调（包括编码链球菌溶血素S和DNA酶的基因），而其他基因，包括编码荚膜、链激酶、链球菌溶血素O和A群链球菌的多基因调控子基因（Mga）在指数生长后期上调。转录调节蛋白通过调节基因表达的活化和抑制实现调节，主要调节蛋白包括：Mga，负责在指数生长期激活表达涉及黏附、内化和免疫逃避的基因；RofA样蛋白，包括ROFA和NRA，调节涉及持续感染的基因；FasA，涉及毒力基因在生长周期的表达；Rgg（RopB），激活胞外蛋白的表达，如SpeB半胱氨酸蛋白酶。Mga自身受生长周期及其他未知环境因素的影响。CovRS（毒力的控制）双组分调控系统直接或间接调节15%的基因组。若干重要的毒力基因的表达直接受CovR应答调节蛋白的调节，包括透明质酸荚膜操纵子、链球菌溶血素S、链激酶编码基因、speB和sda。

大多数与兽医有关的链球菌共生于上呼吸道、消化道和下生殖道。链球菌通过呼吸、性和先天性传播，以及接触性传播。链球菌主要引起皮肤、呼吸道、生殖道、脐部和乳腺的化脓性感染，原发感染后通过血行播散可能导致败血症。在临床上，链球菌病通常以发热、单独或联合败血症为特征[8]，常见继发毒血症和免疫介导性疾病。基本病理过程类似于葡萄球菌感染，病灶有脓液排出，排脓受阻的地方形成脓肿，典型病灶为炎症反应性脓肿，在脓肿中存在宿主细胞碎片和活菌、死菌，镜检可见完整的白细胞和纤维蛋白丝围绕着脓液，若不及时排脓会逐渐形成纤维素性囊。健康个体可能携带上述所有链球菌，许多感染可能是内源性的，与应激有关。针对鸡链球菌的报道目前多集中在防治方面，病原分子生物学特性、致病机理等深入研究未见报道，可能和鸡链球菌病涉及到的链球菌种类繁多有关，但这些链球菌有很多共性，而且常见感染鸡并引起严重后果的多为C群兽疫链球菌和D群粪链球菌，针对性深入研究将有助于鸡链球菌病的防控。