干细胞移植治疗终末期肝病的基础和临床研究现状

崔丽娜，韩 英

(空军军医大学西京医院消化内科，陕西 西安 710032)

肝脏作为人体最大的加工厂，担负着重要的消化、合成、代谢及内分泌调节功能。当发生急性损伤或部分切除后，可以发挥强大的再生能力，在短时间内完成功能和细胞数的恢复。但如果肝脏的慢性损伤持续，尤其是发展至肝纤维化、肝硬化阶段，肝脏再生能力被显著抑制，出现以肝功能减退为主的临床证候群，一旦出现肝功能衰竭，病情很难逆转。如何实现慢性肝病基础上的肝脏损伤修复和再生一直是慢性肝病治疗面临的主要问题。

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。在理论层面上，干细胞的高度自我更新能力使得干细胞可以成为一个源源不竭的细胞库，极大地克服肝细胞移植治疗终末期肝病时肝细胞体外增殖能力有限的问题；干细胞的多向分化潜能赋予了干细胞一定的可塑性，可分化为具有肝功能的肝细胞样细胞。在体外，将干细胞诱导分化为肝细胞，可以解决生物人工肝种子细胞来源困难的问题。在体内，将干细胞经肝动静脉回输入肝脏局部，可分化为肝细胞，从一定程度上提高终末期肝病患者的肝脏功能，改善终末期肝病患者的临床症状。因此，课题组围绕干细胞治疗慢性肝病尤其是肝硬化和肝衰竭等开展了系列基础和临床研究。

1 自体干细胞回输治疗可显著改善肝硬化患者肝功能且不增加肝癌的发生

课题组于2005年建立了自体外周血干细胞经肝动脉回输治疗终末期肝病新技术[1]，即用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)将失代偿期肝硬化患者的骨髓源性干细胞动员至外周血，再分离、采集干细胞，之后经肝动脉回输至患者肝脏。首先通过旨在探讨G-CSF对干细胞疗效影响的40例随机对照研究，明确与单纯G-CSF动员相比，外周血干细胞移植显著升高了患者的血清白蛋白水平、缩短了患者的凝血酶原时间、降低了患者的Child-Turcotte-Pugh(CTP)评分；提示富集后的自体外周血干细胞经肝动脉回输入患者体内后，其对肝功能的改善效果明显优于单纯动员组[2]；进一步通过近10年的长期随访临床研究明确了自体干细胞治疗肝硬化的有效性和安全性。结果显示，自体干细胞移植可显著提升患者肝脏功能(合成能力——白蛋白、胆碱酯酶、凝血提高)，降低终末期肝病模型及CTP评分。患者平均生存期由71个月延长为94个月，5年生存率由52.1%提高为71.2%[3]。

2 干细胞进入体内后可向损伤肝脏归巢并部分转分化为肝细胞

干细胞为混合细胞群，包含间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)等。课题组针对干细胞进入机体后的转归开展了研究：将失代偿期肝硬化患者外周血的干细胞经尾静脉输注入裸鼠体内，发现来自患者的干细胞可以定植于受体鼠肝脏内[4]。随后，将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因雄性小鼠的MSC、HSC或MSC+HSC经尾静脉移植入同品系雌性小鼠体内，分别于2 h、24 h、7 d和28 d检测GFP信号，发现GFP信号首先在小鼠肺内蓄积，2 h后GFP信号在肺内开始逐渐减弱，并在肝脏中一直保持增长趋势，说明移植干细胞进入受体鼠体内后，可向损伤肝脏归巢，并且MSC较HSC归巢能力更强[5]。

干细胞可以分化为肝细胞是干细胞用于肝脏疾病治疗的理论支撑，也是干细胞治疗肝脏疾病的主要机制之一。研究发现成体干细胞的主要组成细胞HSC和MSC，不仅可以分化为血细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等，还可跨胚层界限，分化为肝细胞等[6]。1999年，美国学者PETERSEN等[7]将雄性鼠骨髓移植入四氯化碳诱导的肝损伤雌性鼠模型，并通过2乙酰氨基酸抑制自身肝细胞的再生、刺激卵原细胞的增殖，发现雌性鼠肝脏内存在一些含有Y染色体的卵原细胞及肝细胞，说明来自雄性鼠的骨髓细胞移植入雌性鼠体内后可分化为肝卵原细胞并进一步分化为肝细胞和胆管上皮细胞。课题组从终末期肝病患者的外周血中分离、收集含有干细胞的单个核细胞，将细胞接种于包被有纤连蛋白的培养皿中，并在培养液中加入重组人肝细胞生长因子。7～14 d后，可见培养皿中有具有肝细胞形态的细胞出现。这些具有肝细胞形态的细胞还能够表达成熟肝细胞的标志分子(人白蛋白、CK-18、CYP3A4等)，能够产生或分泌乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、葡萄糖、尿素和白蛋白。提示终末期肝病患者的干细胞在肝细胞生长因子的诱导下可转分化为具有一定形态和功能的肝细胞样细胞[1]。用荧光染料PKH26-GL标记终末期肝病患者的外周血干细胞，并将其从尾静脉注入部分肝切除的裸鼠体内，在裸鼠肝脏中可检测到人白蛋白的表达。由此证明，终末期肝病患者的干细胞在裸鼠体内也可转分化为具有合成白蛋白功能的肝细胞样细胞[4]。

3 miRNA参与MSC肝向分化过程，并可以介导MSC直接转分化为在体内外均可以发挥功能的肝细胞

课题组在成功建立的MSC肝向分化模型基础上，利用miRNA芯片技术共检测了1 205个人类已知的和144个人类病毒相关miRNA分子在肝向分化7个不同时间点的表达变化情况。依据差异倍数和表达含量、实时定量PCR验证，并与骨向分化、肝细胞及肝癌细胞的miRNA谱对比，确定了7个高表达miRNA和8个低表达的miRNA，为肝向分化特异性的miRNA表达谱[8]。包含miRNA干扰序列的慢病毒转染实验结果提示，抑制高表达miRNA分子中的任意一个均可以抑制MSC的肝向分化，说明miRNA分子在MSC肝向分化过程中发挥重要作用。将miR-122、miR-1246、miR-1290、miR-148a、miR-30a、miR-424和miR-542-5p模拟物共同转染入MSC后，可以促使MSC高表达肝脏特异性早、中、晚期标志分子，而不表达肝祖细胞、胰胆上皮标志分子；使MSC的细胞形态从间质样向上皮样转化，并具有肝细胞特异性的功能。移植入肝损伤裸鼠体内后，不仅可以发挥肝细胞的功能，即改善小鼠肝功能，还可以发挥部分MSC的功能，修复小鼠肝组织[9]。课题组进一步通过系统优化，创建了更优化的miRNA组合体系，该组合(miR-122、miR-148a、miR-424、miR-542-5p和miR-1246)不仅可以将MSC直接转化为功能性肝细胞，提高MSC向肝细胞分化的效率，缩短诱导分化时间，也可以提高MSC的抗肝纤维化能力[10]。

4 干细胞移植可以改善肝脏微环境，促进肝再生，减轻肝纤维化

干细胞移植不仅可以提升患者的肝功能，并且可以改善肝组织学。课题组将CCl4诱导的肝硬化大鼠随机分为干细胞移植组和对照组。天狼星红染色和Masson三色染色结果显示，移植后2周，干细胞移植组大鼠的肝纤维化程度较移植前明显减轻，移植后4周，肝纤维化基本消失。而对照组肝纤维化程度较移植前无明显变化。肝纤维化统计学分析结果显示，移植前大鼠肝纤维化程度为(9.3±1.9)%，干细胞移植4周后，大鼠肝纤维化程度下降为(2.1±0.9)%，较对照组[(11.2±2.3)%]明显减低(P<0.01)。移植组大鼠肝组织中肝纤维化相关分子Fibronectin、α-SMA和TGF-β的表达基本消失[11]。干细胞回输治疗可以修复肝组织学的证据在临床标本中也得到了进一步证实。有研究小组进行了自体骨髓MSC治疗酒精性肝硬化的随机对照试验研究(对照组24例，1次干细胞治疗组21例，2次干细胞治疗组23例)，结果显示，干细胞移植治疗12个月内的CTP评分稳定改善，且肝脏胶原面积降低。且2次治疗组较1次治疗组在修复肝组织学方面效果更显著[12]。与此同时，我们发现移植组大鼠肝组织中肝细胞再生指数Ki-67的表达较对照组明显增加，提示干细胞移植在修复肝组织的同时，能促进自身固有肝细胞的再生[11]。此前德国学者将3名右叶肝癌以备择期行右叶切除的患者的骨髓干细胞进行分选，将分选出的CD133+的骨髓干细胞通过门静脉注入到肝左叶，发现回输3周后肝左叶较治疗前明显增大，其肝叶的再生速度是未移植组的2.5倍[13]。说明移植的骨髓源性干细胞在促进肝细胞再生方面发挥重要作用。

干细胞通过改善肝脏免疫微环境改善肝脏纤维化。课题组研究发现，与健康对照组相比，乙肝相关性失代偿性肝硬化患者的多种免疫因子如IL-17明显升高。而MSC移植后IL-17显著降低，并且外源性干预IL-17的水平可直接影响MSC对肝纤维化的治疗效果，提示MSC通过降低炎性细胞因子IL-17的水平修复了肝纤维化[14]。此外，MSC可以分泌多种基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1等)，直接降解胞外基质，减轻肝纤维化[15]。

为阐释MSC抗纤维化机制，靶向提高MSC抗纤维化效率，课题组应用免疫组织化学、基因芯片等方法筛选到了MSC治疗肝硬化的重要因子即TSG-6，发现敲减掉MSC的TSG-6基因后，MSC的肝硬化治疗效果明显减弱。进一步以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)为生物模板，制备了磷酸钙纳米颗粒(CaP@BSA NPs)，并负载TSG-6，即CaP@BSA-TSG-6。该体系提高了肝脏靶向性和TSG-6载药率，并可改善肝纤维化[15]。

综上所述，在系列课题的资助下，经过课题组研究人员的不懈努力，干细胞用于肝脏疾病的基础与应用研究取得了一定的进展。干细胞进入体内后，可向损伤肝脏迁移、通过转分化为肝细胞发挥部分替代作用，通过免疫调节作用从一定程度上改善肝脏微环境，促进肝损伤修复，但其替代作用能发挥多大、持续多久，通过什么措施能增强其替代作用，具体通过什么细胞、什么通路调节肝脏微环境等系列问题尚值得进一步探讨。依据干细胞的定义和特性，干细胞似乎可以完全解决肝细胞移植时细胞不足以及人工肝治疗种子细胞的问题，但在实际应用中，存在分化机制不清、分化程度不足、分化效率低下等问题。此外，在干细胞规范用于肝病治疗之前，仍然需要大规模、多中心、长期随访的临床研究以进一步确认干细胞应用的有效性和安全性，进一步标化种子细胞选择、介入时机及介入手段等系列问题。