精子tsRNA在父系遗传中的作用

许钰薇，李文婧，茅欣怡，马梲铫，丁之德

随着二代测序技术的发展，对于小RNA的检测和研究变得更加快捷、方便。tsRNA（tRNA-derived small RNA），也 称 为tRF（tRNA-derived RNA fragment）、tDR（tRNA-derived small RNA）和tiRNA（tRNA-derived stress-induced RNA）[1]，是一类来源于转运RNA（transfer RNA，tRNA）的小RNA。tsRNA的生成受到血管生成素（angiogenin，Ang）、Dicer、RNA酶Z（RNase Z）和RNase P等酶切割的影响[1]，转录后修饰等过程也对其进行调控。tsRNA是一种重要的RNA调控因子，在蛋白质合成、信使RNA（messenger RNA，mRNA）翻译转录、精子成熟、代际遗传和癌症等病理生理过程中发挥一定的作用。现就tsRNA的分类与功能及其在精子成熟和代谢相关的父系遗传中的作用进行综述，以期对其在代际遗传，尤其在子代代谢性疾病中的作用进一步阐明。

1 tsRNA的分类与功能

1.1 tsRNA的分类tRNA是一种用于mRNA翻译、转录的非编码RNA，长度一般在76～93 nt。成熟tRNA的生成是由tRNA前体（pre-tRNA）经过切割、加工和转录后修饰而成；在其成熟过程中，一段CCA序列会被添加到pre-tRNA的3'端；最终tRNA被折叠成L型，形成3个环状结构，分别为D环、TψC环和反密码子环[1]。tsRNA的分类取决于其从tRNA上被切割的位置，目前共有tRF与tiRNA两类[2]。

1.1.1 tRFtRF通常由Ang或Dicer切割而成，共分为5个亚型：1-tRF、2-tRF、3-tRF、5-tRF和i-tRF[2]。tRF曾被认为在细胞核中合成，但有研究表明其亚种tRF-1001是由ELAC2（ElaC Ribonuclease Z 2）在细胞质中合成，从而推测tRF的合成存在多个途径[1]。

1-tRF是从pre-tRNA的3'端由RNase Z切割而来，一般长度为16～48 nt；通常分散在细胞核与细胞质中[2]。2-tRF仅有4种，从其来源的tRNA反密码子环上不包含5'端和3'端结构的部分被切割下来，能产生2-tRF的4种tRNA分别为tRNA-Glu、tRNA-Gly、tRNA-Asp和tRNA-Tyr前体[3]。2-tRF在缺氧条件下被诱导生成[1]。3-tRF由Ang在成熟tRNA的3'端切割生成，也有部分3-tRF源于成熟tRNA的TψC环；3-tRF有2个亚型——tRF-3a（18 nt）和tRF-3b（22 nt）[4]。5-tRF由酶在成熟tRNA的5'端切割生成，但切割出5-tRF的酶尚不清楚。高通量测序显示，现有的所有加工微小RNA（microRNA，miRNA）的酶都与5-tRF的加工无关，表明tsRNA的加工机制可能与miRNA的加工有所不同[5]。5-tRF分为tRF-5a（14～16 nt）、tRF-5b（22～24 nt）和tRF-5c（28～30 nt）3种亚型[1]。i-tRF主要来源于成熟tRNA的中间区域[1]。

1.1.2 tiRNAtiRNA由Ang在压力环境下（如心脏骤停、紫外线辐射、饥饿、缺氧及病毒感染等），将成熟tRNA从反密码子环上切成两半获得，因此又被称为半tRNA（tRNA halves），其长度可达到30～40 nt[2]。tiRNA可分为3'-tiRNA和5'-tiRNA两类。

3'-tiRNA包含从反密码子环上切割区域到原tRNA 3'端的部分，哺乳动物细胞中3'-tiRNA由Ang切割而成，酵母菌中则由RNY1（ribonuclease from Yeast 1）切割而成；5'-tiRNA包含从反密码子环上切割区域到原tRNA 5'端的部分[2]。

关于tsRNA的分类和命名尚无统一标准，因此在各种研究中会出现诸如3'-tsRNA（包含来源于tRNA 3'端的tsRNA）和5'-tsRNA（包含来源于tRNA 5'端的tsRNA）等名称。高通量测序显示，tsRNA的实际种类远远多于上述几种[1]。因此，关于tsRNA的分类和命名还需要深入研究。

1.2 tsRNA的功能tsRNA在应激反应、表观遗传、蛋白质翻译调控、mRNA翻译转录、新血管生成、精子成熟与免疫反应等方面有着广泛作用，并与许多疾病之间存在关联。

1.2.1 tsRNA在蛋白质合成中的作用tiRNA可以抑制蛋白质的合成。tiRNA（Ala）和tiRNA（Cys）依靠其TOG（a terminal oligo-G motif，一个终末端少G的基本序列）结构能够形成分子间RNA G-四链体（RNA G-quadruplex，RG4），替代mRNA翻译起始复合物eTF4G/eTF4E，从而抑制蛋白质的合成[6]。同时，tiRNA也可通过结合Y盒结合蛋白1（Y-Box Binding Protein 1，YB-1）促进应激颗粒（stress granules）的组装，从而隔离翻译起始因子和蛋白质翻译核糖体，增强对蛋白质合成的抑制[7]。

RNA修饰在蛋白质的合成过程中发挥重要作用。研究表明，假尿苷合成酶7（PUS7）可与多种tsRNA结合，并将其第8位上的U（U8）转变为Ψ（Ψ8），从而调控该tsRNA的生成；其中Ψ8-TOG-5-tRF能够优先与翻译起始复合物中的起始因子细胞质多聚腺苷酸结合蛋白1[poly（A）binding protein cytoplasmic 1，PABPC1]结合，并替代mRNA帽子上的eIF4A/eIF4G复合物，从而抑制蛋白质翻译；研究还发现，PUS7的缺失与蛋白质整体合成的增加有关[8]。

1.2.2 tsRNA在mRNA转录翻译中的作用研究发现，一种长22 nt的3'-CCA-tsRNA可与Argonaute（AGO）蛋白结合，抑制mRNA翻译，表明tsRNA可能具有与miRNA相似的调节基因表达的作用[1]。在对果蝇的研究中发现，3-tRF和5-tRF能够与AGO蛋白结合并抑制靶基因mRNA的翻译，还能优先靶向抑制翻译过程中关键成分[如核糖体蛋白（ribosome proteins，RP）和翻译启动或延伸因子（initiation or elongation factor，IEF）]的mRNA，然而，3-tRF和5-tRF对两者的选择及其作用机制尚不清楚[9]。

tsRNA也可以通过其他方式在mRNA的翻译调节中发挥作用。研究发现，3'-tsRNA-Leu-CAG（一个来源于tsRNA-Leu-CAG 3'端长度为22 nt的序列）能够与核糖体蛋白S28（RPS28）和RPS15的mRNA结合，解开其靶点上成对的二级结构，最终增强40S核糖体的合成[10]。总之，tsRNA通过RNA修饰和RNA二级结构变化等方式对mRNA翻译起抑制作用。

1.3 tsRNA在代谢性疾病中的作用tsRNA被证实参与脂肪细胞的生成和功能，从而对受肥胖影响的糖尿病、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和心血管疾病等代谢性疾病产生作用[2]。tRF-Glu-TTC能够促进小鼠肾周围脂肪组织中脂肪前体细胞的增殖，并同时抑制其分化[11]。在患有NAFLD的小鼠中，升高的tRF-3001b可以靶向抑制自噬相关基因Prkaa1的表达并促进脂质形成，从而促进NAFLD的发展[12]。tsRNA也参与酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）的进程，在ALD患者中检测到tRF-Gly表达升高、Sirtuin1（Sirt1）表达降低，而在ALD小鼠中，tRF-Gly可以通过与AGO3蛋白结合，作用于Sirt1 mRNA的3'非翻译区（untranslated region，UTR），从而下调Sirt1的表达，促进脂肪生成，抑制脂肪酸的β氧化，最终促进ALD小鼠肝脏脂肪变性和肝损伤的发展[13]。

2 tsRNA在精子成熟过程中的表达及修饰

2.1 附睾中tsRNA的来源雄性生殖细胞在睾丸中生成发育，随后在附睾进入成熟阶段；在睾丸精子中，tRNA片段很少，但随着精子在附睾中成熟，tRNA片段逐渐增多[14]。从睾丸进入附睾后，精子中的大部分piRNA（Piwi interacting RNA）转化为tsRNA，piRNA退化的同时伴随tsRNA的数量增加，即小非编码RNA（small non-coding RNA，sncRNA）的含量发生了实质性的改变[15]。同时，在雄性生殖细胞发育过程中，由于出现了个体更大的sncRNA，如tsRNA和rsRNA-28S（28S rRNA-derived small RNA），导致总sncRNA含量持续增加，并且tsRNA和rsRNA-28S自身含量都在由附睾头部转运至尾部的过程中增加[16]。

由于精子具有转录沉默（transcriptional silencing）特性，附睾中sncRNA含量的实质性改变可能是sncRNA与其管腔环境持续性相互作用的结果。Chu等[17]研究发现男性生殖道炎症可显著升高成熟精子中某些sncRNA的含量，如tsRNA和rsRNA-28S。

2.2 RNA修饰对tsRNA的影响tsRNA上存在的RNA修饰可影响其稳定性。研究表明，在哺乳动物雄性生殖细胞内，DNA甲基转移酶Ⅱ（DNMT2）和NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2（NSUN2）介导的5-甲基尿苷（5-methylcytidine，m5C）修饰能增加tsRNA的稳定性[18]。

暴露在氧化应激条件下可诱导哺乳动物细胞中TRMT2A基因下调，从而导致tiRNA形成。如人宫颈癌细胞系HeLa细胞中TRMT2A基因的下调可诱导m5U54（5-methyluridine modification at position 54）tRNA低修饰，进而导致Ang过表达，促进5'-tiRNA的累积（包括5'-tiRNA-GlyGCC和5'-tiRNA-GluCT等）和稳定tsRNA的形成；此外，转录组分析证实，TRMT2A的下调以及m5U54低修饰促进了细胞应激反应和RNA稳定性，而这些改变通常也与tiRNA的产生有关[19]。以上结果证实tRNA低修饰与Ang依赖的tsRNA形成具有相关性，并阐明了m5U54作为tRNA切割保护的标志性作用。

另外，tsRNA上RNA的修饰也增加了RNA结构和功能的多样性。研究表明，广泛存在的N1-甲基腺苷（m1A）能够打破RNA的碱基互补配对原则，从而产生多样的RNA结构和功能[20]。精子来源的内源性tsRNA的稳定性与活性主要依赖于转录后修饰。因此，不同修饰可影响tsRNA的发生与功能，从而促进子代代谢表型的传递[21]。

3 tsRNA在父系遗传中对子代代谢的影响

3.1 影响子代代谢性疾病的父代暴露因素多项研究表明，父代暴露在多种环境因素下可在子代中引发出生后特征的改变，如代谢紊乱等。若父代肥胖，其子代更容易患有代谢性疾病，并且父代可能将代谢性疾病直接遗传给子代[22]。Chen等[23]将正常饮食（normal diet，ND）和高脂饮食（high-fat diet，HFD）雄性小鼠的精子分别用于体外受精，并将2组受精后的胚胎转入正常饮食的健康代孕母鼠子宫内，结果发现HFD雄性小鼠的子代在给予HFD喂养时更易发生糖耐量受损和胰岛素抵抗。

雄性暴露于一系列环境危害因素，其精子的小RNA图谱发生改变，并将父代行为和代谢表型传递给子代[24]。Sarker等[22]在HFD雄鼠的子代F1雄鼠中提取富含tsRNA的精子RNA片段（30～34 nt）并进行合子注射，发现可影响F2代的成瘾性行为和代谢表型。

此外，父代早年的创伤应激也会改变子代的行为和代谢反应。突然失去母鼠或经历其他心理创伤的雄性幼鼠（F1），成年后更容易出现抑郁、行为控制能力丧失、认知功能及社交技能受损等症状；其子代（F2）可表现出与F1代小鼠相似的行为症状，还会出现代谢紊乱和对胰岛素过度敏感导致的低血糖等症状[25]。提示父代的压力应激可能会导致子代的代谢紊乱。

3.2 父代暴露因素影响子代代谢的可能机制tsRNA能够促进哺乳动物特定代谢表型的传递。在HFD和ND小鼠中，精子tsRNA（18～40 nt）的种类存在显著差异；将HFD和ND小鼠精子中15～25 nt、30～40 nt和＞40 nt 3种不同长度的tsRNA片段分离纯化后分别注射到正常受精卵中，只有注射了30～40 nt tsRNA的子代产生了与注射精子总RNA子代类似的代谢效应[23]。表明精子tsRNA与精子总RNA的信息相似，是诱导子代获得性代谢紊乱过程中的必要条件。此外，tsRNA对精子总RNA的调控也影响了tsRNA介导的跨代表观遗传。Chen等[23]还发现miRNA与tsRNA均参与获得性代谢紊乱的代际遗传，对HFD和ND雄鼠精子tsRNA的RNA修饰进行研究，发现在HFD组中m5C修饰和m2G修饰较ND组显著上调，而在miRNA中则未观察到明显变化。提示精子tsRNA相较于miRNA对高脂更加敏感，印证了tsRNA在介导父系获得性代谢紊乱中的关键作用。

在人类精子中还发现了一种新的内源性tsRNA，它是通过整段tRNA的T环序列特异性裂解而产生，由于这种分裂方式仅观察到来自核DNA而非线粒体DNA的tRNA，因此，这些tsRNA被命名为核内T环tsRNA（nuclear internal T-loop tsRNA，nitRNA），其可促进精子运动[26]。Nätt等[26]研究发现，来自多物种的nitRNA在高糖饮食1周后就开始上调；在健康年轻男性中也观察到这种上调现象，但在肥胖男性的样本中，同样的nitRNA反而下调。表明在健康状态下，nitRNA对高糖敏感；发生代谢性疾病状态下，nitRNA合成受到抑制。该研究在对nitRNA进行分析时发现，所有nitRNA在T环中都含有相同的TTCGA序列，TTCGA序列与至少2个RNA PUS（TURB1和PUS7）的目标序列非常相似。在人类胚胎干细胞中，PUS7介导的RNA假尿苷化可稳定由D环切割产生短5'-tsRNA，随后短5'-tsRNA会干扰参与翻译作用的核糖体，从而导致蛋白质的翻译受到抑制[8]。以上结果表明在RNA修饰和稳定性、精子nitRNA及蛋白质翻译之间可能存在一定的关联，nitRNA可能在急性和慢性代谢状态中均发挥作用，但其具体机制还需进一步研究。

另有研究表明，对HFD父系精子RNA提取后进行合子注射可以诱导小鼠早期胚胎和子代组织中代谢相关基因信号通路中DNA转录的改变[23]。一种解释可能是，一旦在胚胎早期触发异常代谢状态，胚胎的代谢物或线粒体功能可能会发生变化，并进一步触发持续影响代谢状态的连锁反应，而连锁反应可能通过表观遗传反馈到细胞核，使子代发生代谢性疾病或增加其发生风险。此外，Chen等[27]通过对高质量精子和低质量精子受精获得的胚胎进行比较发现，不同长度的tsRNA-Gln-TTGs（30～36 nt）在高质量精子和低质量精子中的含量存在明显差异，表明人类精子tsRNA-Gln-TTGs含量与胚胎质量有关，可能作为潜在的诊断性生物标志物。研究证实小鼠精子中的5'-tiRNA-Glu和5'-tiRNA-Gly能够抑制与内源性逆转录因子MERVL相关的基因表达，可能在胎盘功能与胚胎早期发育中存在影响[14]。

3.3 tsRNA在表观遗传调控与种系介导的代际遗传中的作用当精子穿过附睾时，小RNA被大量重塑，piRNA被降解并生成大量的tsRNA[15]。这些tsRNA的改变不仅能够支持受精，并且在受精时被输送到卵母细胞后还能支持正常的胚胎发育[28]。修饰后的精子tsRNA可能通过靶向特定的核糖体重新编程胚胎代谢状态，从而影响胚胎发育的轨迹。因此，以精子RNA密码形式存在的父系环境信息可能被转化为胚胎的“核糖体密码”，以产生翻译的特异性并最终确定后代的代谢表型[29]。

4 结语与展望

精子中的tsRNA与父系遗传密切相关。tsRNA在附睾中大量合成和修饰后，通过受精过程遗传给子代，促进了代谢表型的传递。如精子tsRNA会受到父代暴露因素（肥胖和心理等）的影响，这些暴露因素能够影响tsRNA的种类以及其对细胞核RNA、转座子和染色体可及性（chromatin accessibility）等的调控，从而影响下一代的代谢表型。因此，研究tsRNA对子代代谢性疾病的预防和治疗具有重大临床意义。然而，tsRNA在精子中生成和调控的机制仍需更多的研究进一步证实。