新型冠状病毒肺炎患者恢复期PBMC 中SARSCoV-2 中和抗体检测分析

陈智伟 陈敏红 谢迺鸿 张彩云 卢园 姚栩

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)主要是由急性呼吸综合征冠状病毒-2(acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)所引起的肺炎,2019 年12 月底以来,该病在全球范围内迅速蔓延,确诊病例约2.1 亿,累计死亡病例约450 万,已成为影响世界各国的严重公共卫生事件［1,2］。关于该症,目前临床尚无特效药,主要采用抗病毒及支持疗法,可在一定程度上控制病情发展,挽救患者生命安全［3］。临床有报道显示,机体感染SARS-CoV-2 后,会使其人体免疫系统被激活,从而会产生针对性抗体,而抗体检测为病毒感染的重要诊断方法,其标本主要来源于血清、血浆、外周血等标本,采集和保存均较简单,可明显减少医护人员采集咽拭子时发生感染的风险,具有明显的价值。此外,外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)主要是指外周血中具有单个核的细胞,机体感染SARS-CoV-2 后则会产生PBMC,因此,了解恢复期患者PBMC 中SARS-CoV-2 中和抗体水平具有必要性,可评价PBMC 中是否具有特异的抗SARS-CoV-2 作用,以期为临床治疗该症提供新的方向［4］。本文收集SARS-CoV-2 感染中恢复的40 例福州地区COVID-19患者的血浆,通过假病毒中和实验筛选具有中和效果患者的PBMC,进行记忆B 细胞筛选及检测,为临床早期诊断及治疗该病提供指导。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集SARS-CoV-2 感染中恢复期的40 例福州地区COVID-19 患者的血浆进行回顾性分析,其中男22 例、女18 例；年龄25～53 岁,平均年龄(39.00±6.11)岁；体质量指数19～25 kg/m2,平均体质量指数(22.00±1.12)kg/m2。本文研究符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：SARS-CoV-2 感染者；具有发热症状、肺部影像学检查结果异常,亚段或节段性磨玻璃影或病灶实质、磨玻璃影与实变影并存,累及多个肺叶；痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等样本SARS-CoV-2 核酸检测阳性；知情且签署同意书。排除标准：合并严重免疫系统、血液系统疾病者；合并严重心脑血管疾病；肝肾功能不全者；伴或不伴甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等阳性；合并其他严重恶性肿瘤疾病者；具有精神类疾病病史,无法正常沟通交流者；临床资料不完整；依从性不佳者。

1.3 方法

1.3.1 标本收集及假病毒验证 构建含有SARSCoV-2-S 基因的重组质粒pcDNA3-1-SARS-CoV-2-S,与缺失Env 基因、含荧光素酶报告基因的2019-NCOV骨架质粒pNL4-3-Luc-RE 共转染293T 细胞,取含假病毒的上清,以Western 印迹法、细胞感染实验、血清中和试验,确定是否包装出新冠状病毒假病毒,及是否能有效用于细胞感染、中和试验。

1.3.2 记忆B 细胞筛选、RNA 和VDJ 测序 将生物素化的S 蛋白、RBD 蛋白偶联至磁珠上,应用偶联抗原蛋白的磁珠富集血清中记忆B 细胞,分离出免疫球蛋白(Ig)G1克隆亚型,从中筛选出候选抗体,以待研究。以高通量单细胞测序法,对患者血清中记忆B 细胞进行RNA、VDJ 测序,以数据分析找出大量抗体表达的IgG1 克隆亚型,将其中单克隆抗体进行表达纯化,进行IgG1 抗体与RBD 结合实验,若其中仅有一种IgG1有较弱的中和活性,则表明这一轮中和抗体筛选是否成功。

1.3.3 获得的中和抗体进行假病毒中和实验 所获得的中和抗体中,发现仅有与RBD 结合的抗体呈中和活性,且与RBD 的亲和力接近或大于ACE2/RBD 抗体,中和活性较强。选择半抑制浓度(IC50)值＜0.05 μg/ml的单克隆抗体,用于假病毒实验,其中命名为BD-368-2 的单克隆抗体的中和活性最强。

1.3.4 SARS-CoV-2 中和抗体效价检测 取待测血清,置于96 孔细胞培养板中稀释至一定浓度,进行3 倍系列稀释,加入一定滴度的假病毒液,混合后将其放置于37℃环境中,持续孵育1 h,将Huh-7 细胞,应用胰蛋白酶消化成单个细胞悬液,接种上述96 孔细胞培养板,每孔中加入2×104个/100 μl 细胞,于37℃、5%的CO2培养箱中进行培养,24 h 后行化学发光检测。初筛：以1∶30 倍进行稀释,对SARS-CoV-2 中和抗体进行检测,若抑制率在50%及以上,行复试,采用1∶30、1∶90、1∶270 的梯度,检测复试为阳性的标本,针对VSV、SARS、MERS 病毒中和活性,分析中和特异性。

1.4 观察指标 分析SARS-CoV-2 中和抗体检测结果。

2 结果

此次筛选的中和抗体中获得5 个中和效果较好以及亲和力高的抗体,为进一步检测阳性样本的中和作用是否为SARS-CoV-2 特异性中和,对VSV、SARSCoV、MERS-CoV 进行检测。检测结果显示：编号为415、726、1151 的样本阳性,于1∶30 稀释度下,对于3 种病毒具有微弱的抑制性,表明此中和为非特异性中和作用；编号130、642、1143 的样品,对于2 种病毒具有较弱的中和作用；采用1∶90、1∶270 的梯度进行稀释时,所有样本检测结果均为阴性。

3 讨论

COVID-19 在全球的蔓延,已严重威胁到人们的生活、生命健康,降低国民生活质量［5-7］。核酸检测为诊断COVID-19 的有效方法,但由于技术及操作复杂等因素,检测时间一般为5～6 h,不适用于快速诊断,也无法满足当前排查诊断的检测需求［8-10］。此外,由于大体积反应系统、非特异性扩增,极易导致假阳性,而由于标本采集时间、部位、标本运输、保存等外界因素的影响,极易导致假阴性,影响诊断结果［11］。因此,及时寻求一种更快、更便捷、更有效的检测方法具有必要性。人体感染SARS-CoV-2 后,会激活人体免疫系统,产生针对性抗体,而抗体检测为病毒感染的重要诊断方法,标本主要来源于外周血、血清、血浆标本,采集、保存简单易行,可显著降低医护人员因采集咽拭子感染的风险,SARS-CoV-2 感染后,患者核酸转阴后,抗体仍可存在［12］。因此,抗体检测对于SASRCoV-2 疫情的回顾性诊断、流行病学的调查具有十分重要的意义。

根据目前研究及流行病学报道,现有确诊依据主要为呼吸道样本中检出病毒核酸,但SARS-CoV-2 主要存在于下呼吸道,而鼻咽拭子由于其易采集、患者接受度高等优势,为目前临床最常用的标本［13,14］。但核酸试剂盒质量参差不齐,操作人员水平各有差异,极易导致误诊、漏诊等不良事件的发生［15］。此外,SARS-CoV-2 在引物设计上可以参考的序列有限,且会出现变异的情况,若采样人员培训不到位,极易导致采样不合格,采样部位不同也会导致敏感性出现差异,从而导致SARS-CoV-2 核酸检测的假阴性结果明显增多,使部分疑似患者无法及时确诊、及时治疗,导致不良的预后结果。为进一步分析恢复期患者SARS-CoV-2中和抗体检测结果及价值,本文收集SARS-CoV-2 感染中恢复期的40 例福州地区患者的血浆进行回顾性分析,研究结果显示,编号为415、726、1151 的样本阳性,于1∶30 稀释度下,对于3 种病毒具有微弱的抑制性,表明此中和为非特异性中和作用；编号130、642、1143 的样品,对于2 种病毒具有较弱的中和作用；采用1∶90、1∶270 的梯度进行稀释时,所有样本检测结果均为阴性。提示,本文所选取的样本中,于较低的稀释浓度下(1∶30),具有中和新型冠状病毒的能力,之后,对假病毒载体相关的VSV、类似的冠状病毒进行非特异性的分析,证实所有样品的中和活性,均为非特异性中和,由此可见,恢复期患者PBMC 中新型冠状病毒SARA-CoV 中和抗体具有显著的检测价值,可为临床治疗COVID-19 患者提供参考。SARS-CoV-2 特异性抗体可作为核酸检测的重要补充,若疑似患者的核酸检测为阴性,则可对其抗体进行连续性的检测,若抗体检测出现阳性,则应引起临床的高度怀疑。但假病毒中和抗体检测实验,主要是基于细胞学的试验,存在一定的误差,应进一步增加实验次数,设定不同系列稀释度的方法,确定最终阳性样本。

综上所述,COVID-19 恢复期患者PBMC 中新型冠状病毒SARS-CoV-2 中和抗体检测结果显示,PBMC中具有特异的抗SARS-CoV-2 作用,为临床治疗该病提供参考,临床价值显著,可继续推广。本文研究对于临床治疗COVID-19 提供新的研究方向,具有较高的临床价值,但本文研究仍存在一些不足之处,例如所选取的样本数量相对较少,样本研究时间相对较短,关于恢复期患者PBMC 中新型冠状病毒SARS-CoV-2 中和抗体检测价值,有待临床进一步研究及探讨。