干细胞来源外泌体通过调控MMP-9 表达减轻脊髓损伤的机制分析

王东 郜振武 杨秋荟 孙留群 杨学斌 陈晨

血脊髓屏障中的粘附连接蛋白与紧密连接蛋白能够防止外周循环物质进入骨髓。脊髓受损后,血脊髓屏障随之受损,使血细胞进入脊髓,产生炎症反应,导致脊髓受损和神经功能永久性损伤［1］。基质金属蛋白酶在血脊髓屏障受损中起主导作用,而屏障损伤是造成继发性损伤的影响因素［2］。说明维持脊髓屏障的完整及正常功能可能有助于减轻脊髓损伤和恢复神经系统。间充质干细胞移植治疗脊髓损伤疗效确切,而外泌体是间充质干细胞旁分泌机制的重要成分［3］。临床上将骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源外泌体用于治疗心血管等疾病,但目前在脊髓损伤方面的研究较少。基于此,本研究将构建大鼠脊髓损伤模型,移植干细胞来源外泌体,探讨其通过MMP-9 表达减轻脊髓损伤的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞来源 BMSCs(厂家：广州赛业生物科技有限公司)选自大鼠股骨骨髓。

1.1.2 实验大鼠 选取60 只SD 大鼠(厂家：珠海百试通生物科技有限公司),体质量约200 g,本研究于2021 年1 月～2022 年1 月在白求恩医院基础医学实验室完成,本研究经白求恩医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BMSCs 复苏后,用10%胚胎牛血清(厂家：Ausbian；货号：WS500T；规格：500 ml/瓶)和1%青霉素(厂家：普利莱；货号：APC8250-5；规格：5 g)和链霉素DMEM/F12 完全培养基培养,1 d 后换成新鲜完全培养基,待细胞融合率达80%时通过0.25%胰酶消化,并以1∶4 的比例传代。

1.2.2 提取外分泌体 从细胞培养上清液中提取外泌体,首先使用超滤离心管将胎牛血清离心55 min(3000×g),获取去外泌体胎牛血清。当干细胞融合率约70%时,更换含10%去外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基,培养36 h,按试剂盒说明书进行外泌体提取。

1.2.3 构建脊髓损伤模型及注射外泌体 将60 只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组及外泌体组,每组20 只。构建大鼠脊髓损伤模型(改良Allen's法),大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(3 ml/kg)麻醉,作切口后切除椎板,充分暴露T9～10段脊髓,在T10处造成重度损伤,术毕用0.9%氯化钠冲洗,缝合伤口。持续3 d 抗生素方案,手动排空膀胱至大鼠排尿功能恢复正常。假手术组不对脊髓进行打击,仅行T10椎板切除术。外泌体组在脊髓损伤30 min 和1 d 后进行干细胞来源外泌体尾静脉注射(200 μl)。模型组分别于损伤后30 min、1 d 经尾静脉注射200 μl PBS 缓冲液。

1.2.4 运动功能评定 采用BBB 评分对大鼠运动功能进行评定,评分范围0～21 分,0 分表示无自主运动；21 分表示正常自主运动,动作协调。大鼠于造模前及造模后第1、3、5、7、10、14、21 天在防滑、平坦的塑料板上自由移动,观察5 min。在双盲条件下由2 位掌握BBB 评分执行标准的研究组员对大鼠进行运动功能评定。

1.2.5 伊文思蓝染色 在大鼠脊髓损伤后第3 天,注射2%伊文思蓝溶液(2 ml/kg)于大鼠尾静脉,2 h 后麻醉大鼠(1%戊巴比妥),用0.9 氯化钠溶液灌注至右心房流出的液体为澄清样。将脊髓损伤节段与50%TCA溶液充分匀浆后离心10 min(10000×g),将上清液用分光光度计在发射波长620、680 nm 下检测样品吸光度。将样品吸光度转化成每克组织中所含染料微克数。

1.2.6 Western blot 检测 用RIPA 裂解液将脊髓组织匀浆后于冰上裂解30 min,在4℃条件下离心10 min(12000×g),用BCA 蛋白质定量法分析上清液总蛋白含量。电泳分离样品,将蛋白转移至PVDF 膜上,室温密封1 h,再将claudin-5、Occludin、ZO-1、MMP-9 一抗加入在4℃下过夜,加入HRP 标记的二抗室温孵育1 h。以β-actin 为内参,获取条带灰度值,蛋白水平的表达形式为目的条带灰度值/β-actin 带灰度值。

1.2.7 明胶酶谱法 采用明胶酶谱法检测MMP-9 活性,取损伤脊髓节段,在裂解缓冲液中匀浆,离心后分析上清液蛋白含量,加入缓冲液混匀,待蛋白量上样后洗脱变性,漂洗40 min,放入孵育液37℃48 h,染色2 h,再用脱色液脱色至出现条带,拍照记录分析。

1.3 观察指标 ①比较三组大鼠脊髓损伤后不同时间点的BBB 评分；②比较三组大鼠染料渗出量；③比较三组大鼠紧密连接蛋白(claudin-5、ZO-1、Occludin)表达水平；④比较三组大鼠脊髓组织中MMP-9 表达水平及活性。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用F检验,两组比较采用独立样本t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠脊髓损伤后不同时间点的BBB 评分比较 假手术组大鼠无行动障碍,BBB 评分均为21 分。外泌体组、模型组大鼠脊髓损伤后运动功能均受损,第1 天BBB 评分为0 分,两组大鼠脊髓损伤后第3、5、7 天BBB 评分比较差异无统计学意义(P＜0.05)；外泌体组大鼠脊髓损伤后第10、14、21 天BBB 评分高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1,图1。

表1 三组大鼠脊髓损伤后不同时间点的BBB 评分(±s,分)

表1 三组大鼠脊髓损伤后不同时间点的BBB 评分(±s,分)

注：与模型组比较,aP＜0.05；“-”表示无数据

图1 三组大鼠脊髓损伤后不同时间点的BBB 评分

2.2 三组大鼠紧密连接蛋白表达水平及血脊髓屏障染料渗出量比较 三组大鼠损伤后第3 天血脊髓屏障染料渗出量及claudin-5、ZO-1、Occludin 表达水平比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。外泌体组大鼠脊髓损伤后第3 天血脊髓屏障染料渗出量少于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)；外泌体组大鼠claudin-5、ZO-1 及Occludin 相对表达量高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 三组大鼠紧密连接蛋白表达水平及血脊髓屏障染料渗出量比较(±s)

注：与模型组比较,aP＜0.05

2.3 三组大鼠脊髓组织中MMP-9 表达水平和活性比较 Western blot 检测结果显示,三组大鼠脊髓组织中MMP-9 表达水平和活性比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。外泌体组大鼠脊髓组织中MMP-9 表达水平低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)；外泌体组大鼠脊髓组织中MMP-9 活性低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 三组大鼠脊髓组织中MMP-9 的表达水平和活性比较(±s)

表3 三组大鼠脊髓组织中MMP-9 的表达水平和活性比较(±s)

注：与模型组比较,aP＜0.05

3 讨论

脊髓损伤除影响感觉、运动和自主神经功能外,还会出现慢性疼痛、肌肉萎缩等继发性问题。在临床实验中,脊髓损伤可进一步造成血管损伤、血脊髓屏障破裂。基质金属蛋白酶、肿瘤坏死因子-α 等都参与破坏脊髓损伤后的血脊髓屏障［4］。

干细胞治疗脊髓损伤有良好的治疗效果。本研究结果显示,大鼠脊髓损伤后运动功能均受损,第1、3、5、7 天,外泌体组和模型组BBB 评分比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；外泌体组第10、14、21 天BBB 评分高于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05),表明外泌体能促进运动功能恢复。BMSCs 移植可以通过髓内、鞘内、动脉内或静脉内途径加速脊髓损伤后神经功能修复［5,6］。数据显示,进入损伤部位的BMSCs 通过旁分泌机制发挥作用,并不会完全分化成神经元或神经胶质细胞［7］。外泌体是BMSCs 分泌的细胞外囊泡的主要成分,携带如miRNA 等重要活性物质［8］。

外泌体是脂质双层膜结构,可避免其内容物被吸收或分泌,从而使它们能够自由地从血脊髓屏障到达损伤部位。BMSCs 来源外泌体可预防神经元凋亡、抗炎和抗瘢痕形成,并促进脊髓损伤后的功能恢复［9］。Lu 等［10］的研究表明,BMSCs 来源的外泌体可降低NF-κB p65 信号调控,限制周细胞迁移,增强周细胞覆盖,使血脊髓屏障通透性下降。本研究结果显示：损伤后第3 天外泌体组血脊髓屏障染料渗出量少于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；外泌体组claudin-5、ZO-1 及Occludin 相对表达量高于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05),进一步补充了外泌体可防止紧密连接蛋白降解降低血脊髓屏障的通透性。同时本研究Western blot 检测结果显示：外泌体组MMP-9 表达水平低于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；外泌体组MMP-9 活性水平低于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05),提示BMSCs 来源外泌体能通过抑制MMP-9 表达减少紧密连接蛋白claudin-5、Occludin、ZO-1 的降解,从而加快血脊屏障的修复。

综上所述,干细胞来源外泌体可通过抑制MMP-9表达和活性降低紧密连接蛋白的降解,改善血脊髓屏障的破坏,从而加速恢复大鼠脊髓损伤后运动功能。外泌体不仅能自由通过学脊髓屏障,还具有低免疫原性,在治疗中枢神经系统损伤中有较大的治疗潜力,其可能成为脊髓损伤一种具有前景的治疗策略。