基于UPLC-QE-MS 技术的畅脉乐胶囊化学成分分析及其抗脑血栓的网络药理学研究

翁一玲 李煌 卓辰茜 刘婉婷 陈松旺

脑血栓是脑梗死常见类型之一,其发病急,病情进展迅速,致死风险较高,发病率逐年增加,并呈现年轻化趋势,故临床上需对脑血栓予以积极治疗［1］。西医多采用溶栓治疗加脑神经保护,可在一定程度上缓解脑血栓症状。近年来,中西医结合治疗脑血栓取得了良好的进展,中药多选择活血化瘀方药［2,3］。畅脉乐胶囊是福建省第二人民医院根据陈美华主任的多年经验研制的院内制剂,具有滋肾活血、祛风通络的功效。该处方由黄芪、丹参、郁金、赤芍、葛根等多味中药组成,方中黄芪补中益气,丹参通利血脉,赤芍凉血散瘀,郁金、葛根有助于在活血祛瘀通络的同时不伤正气。全方兼备攻补,共同发挥活血益气功效。目前,畅脉乐胶囊在临床上常用于防治中老年血管硬化或脑卒中后遗症［4,5］。在中药的质量控制方面,目前研究主要集中于某一种或几种标记化合物的定量分析。中药多成分、多靶点、多途径的作用特点已被广泛认识,但是,从数以万计成分的复杂中药体系中获取有用的化学信息一直是研究人员面临的挑战。UPLC-QE-MS 具有高分辨率和灵敏度,已成功用于复杂样品的分析,以此可以作为一种快速、全面地识别中药化学成分的策略［6］。近年来,网络药理学作为一种高通量筛选,运用网络可视化及网络分析等多种技术,已经广泛用以揭示药物、靶点、疾病间复杂的网络关系,从多维度理解药物的作用机制,这为中药研究中的多成分多靶点作用机制研究提供新的研究思路［7］。本研究采用UPLCQE-MS 技术对畅脉乐胶囊化学成分快速分析,并进行其抗脑血栓的网络药理学研究,旨在为院内制剂质量评价和阐明其药效作用机制提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 Vanquish 型超高效液相色谱仪、Orbitrap Exploris 120 型高分辨质谱(购自美国赛默飞世尔科技公司)；BSA124S-CW 型天平(德国赛多利斯公司)；JXFSTPRP-24 型研磨仪(上海净信科技有限公司)；明澈 D24 UV 性纯水仪(默克密理博公司)；YM-080S 型超声仪(深圳市方奥微电子有限公司)；色谱柱(100×2.1 mm,1.7 μmWaters ACQUITY UPLC BEH C18)。

1.2 试剂 畅脉乐胶囊(规格：0.5 g/粒,批号：20211224,由福建中医药大学附属第二人民医院制剂室提供)；甲醇、乙腈(色谱纯,均购自CNW Technologies)；甲酸(色谱纯,购自美国SIGMA 公司)；L-2-氯苯丙氨酸(纯度≥98%,购自上海恒柏生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 畅脉乐胶囊化学成分定性分析

1.3.1.1 色谱条件与质谱条件 色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm,1.7 μm)；流动相0.1% 甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～3.5 min,5%～15% B；3.5～6.5 min,15%～30% B；6.5～12.5 min,30%～70% B；12.5～25.0 min,70%～100% B；25～30 min,100%～5% B),体积流量400 μl/min;柱温为40 ℃；进样量5 μl；进样室温度4℃。

Orbitrap Exploris 120 质谱仪能够在控制软件(Xcalibur,Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScanddMS2 功能进行一级、二级质谱数据采集。具体参数：鞘层气体流速30 Arb；辅助气体流速10 Arb；离子传输管温度 350℃；蒸发器温度350℃；全ms 分辨率 60000；ms/ms 分辨率15000；NCE 模式碰撞能量：16/38/42；喷射电压：5.5 kV(正)或-4 kV(负)。

1.3.1.2 畅脉乐胶囊的前处理 称取100 mg 的畅脉乐胶囊内容物,加入500 μl 提取液(甲醇∶水=4∶1,内标浓度为10 μg/ml)；涡旋30 s,45 Hz 匀浆4 min,冰水浴超声1 h；-40 ℃静置1 h 后将样本4 ℃,12000 rpm［离心力13800(×g),半径8.6 cm］离心 15 min；小心取上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤；转移到自动进样瓶中,用于UPLC-QE-MS 分析。

1.3.1.3 数据处理与分析 原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML 格式后,使用XCMS 软件将质谱原始导入,进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作,利用自建二级质谱数据库及相应裂解规律匹配对含有MSMS 数据库进行物质鉴定。

1.3.2 畅脉乐胶囊网络药理学分析

1.3.2.1 畅脉乐胶囊有效成分代谢靶点的获取 通过检索 TCMSP 数据库 (http://tcmspw.com/tcmsp.php)得到畅脉乐胶囊组方中葛根、丹参、郁金、赤芍和黄芪的所有活性成分,将口服生物利用度(OB) 设为＞30%,类药性(DL)设为＞0.18 筛选及统计出畅脉乐胶囊的有效成分。同时筛选出有效靶点,导入Uniprot 数据库进行标准化处理。

1.3.2.2 脑血栓治疗靶点的获取 运用 GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/),以“Cerebral Thrombosis”为主题词进行相关检索,查得脑血栓治疗靶点,将结果导入EXCEL 表格中分析处理,并建立数据集。

1.3.2.3 成分-靶点相互作用网络的建立 为了更明确、清晰地阐述畅脉乐胶囊抗脑血栓的作用机制,利用在线韦恩图Venny2.1 绘制韦恩图Venn Diagram,得到交集靶点。整理后的药物有效成分与靶点交集靶点导入Cytoscape3.7.2 软件中,获得成分-靶点相互作用网络图。

1.3.2.4 靶点GO 功能分析以及KEGG 通路富集分析将上述已获得的关键靶点基因转化为基因ID,运用GO (http://www.geneontology.org/) 进行功能注释以及富集分析,同时对相关靶点利用KEGG 网站搜索数据库提供的绘图模块进行靶点蛋白渲染。

1.3.2.5 靶点蛋白的PPI 网络构建分析 把上述获得的交集靶点输入STRING 数据库构建靶点蛋白的网络互作图。加入代谢物与靶点蛋白节点关系、靶点蛋白与通路节点关系,进一步阐述畅脉乐胶囊抗脑血栓的代谢物-靶点-通路的网络构建分析。

2 结果

2.1 畅脉乐胶囊化学成分定性分析结果 研究结果表明：在Composite Score ＞0.99 的情况下,畅脉乐胶囊的正离子模式共鉴定成分79 个,负离子模式共鉴定成分47 个。见图1。正负离子模式下畅脉乐胶囊鉴定出的化学成分可分为20 种类型,分别是氨基酸衍生物、苯及取代衍生物、脂肪酸类、脂肪酰类、黄酮类、寡糖类、酚类、糖类多酮类、苯丙素类、萜类、生物碱、酰胺类、香豆素及其衍生物类、二萜类、神经递质类、有机酸及其衍生物、酚醚类、有机羟基化合物、异戊烯醇脂类及其他类。

图1 畅脉乐胶囊UPLC-QE-MS 检测正(A)、负离子(B)模式TIC 图

2.2 畅脉乐胶囊有效成分作用靶点及有效成分-疾病-作用靶点筛选 经过检索,得到畅脉乐胶囊复方中的有效成分对应靶点577 个,在GeneCards 数据库中查得脑血栓形成靶点共2284 个。将有效成分靶点与脑血栓形成靶点取交集,共得到267 个交集靶点,见图2。具体靶点见表1。

表1 药物-疾病有效交集靶点

图2 有效成分靶点-药物靶点韦恩图

2.3 GO 功能分析以及KEGG 分析结果 将上述过程中获得的相应靶点导入GO 数据库进行功能富集性分析,得到生物过程(BP)3316 个、细胞组分(CC)163 个、分子功能(MF)434 个条目,包括蛋白质自磷酸化、对有毒物质的反应、肽基-丝氨酸磷酸化、肽基-丝氨酸修饰对氧化应激的反应、对异种刺激的反应等生物过程起作用。GO 分析各分类排名前五结果见表2。KEGG 通路富集分析得到194 条相关通路,其中富集程度显著的有脂质和动脉粥样硬化、神经活性配体-受体相互作用信号通路、钙信号通路、炎症介质对TRP通道的调节及HIF 信号通路等。KEGG 通路富集分析靶点蛋白个数排名前五结果见表3。

表2 GO 分析畅脉乐胶囊抗脑血栓关键靶点各分类排名前五结果

表3 KEGG 代谢通路富集分析畅脉乐胶囊靶点蛋白个数排名前五结果

2.4 靶点蛋白的PPI 网络构建分析 运用STRING 数据库,输入药物靶点与疾病靶点数据集中相交的267 个有效靶点,手动设定物种为“Homo sapiens”。利用靶点蛋白之间相互关系构建靶点蛋白可视化互作网络。链接节点最多的20 个靶点基因见图3,这些靶点可能是畅脉乐胶囊作用于脑卒中的核心靶点。

图3 蛋白互作网络中 20 个核心基因

3 讨论

脑血栓作为一种常见的心脑血管疾病,多因大脑供血不足,导致血液粘度升高,凝血因子聚集形成血栓堵塞血管,引起侧支循环不畅,进而造成神经功能损伤。而畅脉乐胶囊能够调节血管舒张功能,从而修复血管内皮损伤,对脑血栓具有治疗作用。

本研究利用UPLC-QE-MS 技术对畅脉乐胶囊化学成分进行定性分析,得到20 种化学成分,包括黄酮类、萜类、苯丙素类等。黄酮类化合物主要通过抗炎抗氧化,抑制血小板活化和相关信号转导,改善血脑屏障通透性和血液流变学,对脑缺血再灌注损伤具有保护作用［8］。畅脉乐胶囊处方中君药黄芪的主要活性成分槲皮素、山萘酚为黄酮类靶点较多的有效成分,黄芪甲苷为萜类靶点较多的有效成分,主要通过减少脑部缺血组织细胞的凋亡、抑制炎症反应、抑制血小板活性等减轻神经功能的损伤［9］。萜类靶点较多的成分还有芍药苷、大豆皂苷等。芍药苷可显著降低脑缺血大鼠的神经功能缺损评分,改善神经功能损伤［10］。丹参的有效成分较多,如苯丙素类的丹酚酸、丹参素,二萜类的丹参酮等,通过抑制炎性反应及细胞凋亡发挥神经保护作用［11,12］。

本研究通过构建有效成分-靶点-疾病相互作用网、韦恩图以及PPI 网络图得到畅脉乐胶囊抗脑血栓形成的交集靶点267 个,TP53、AKT1、TNF、IL-6 等可能为核心靶点。研究发现,TP53 是程序性细胞死亡、细胞周期、DNA 修复和基因组稳定血管生成和转移的抑制及其他功能的关键调节剂［13］。AKT1 调节几个关键的内皮细胞和血管平滑肌细胞功能,包括细胞生长、迁移、存活和血管张力,AKT1 的缺失会导致严重的动脉粥样硬化和闭塞性冠状动脉疾病［14,15］。TNF-α 是常见的炎症因子之一,炎症反应会提高血脑屏障的通透性,使大量炎性因子如白细胞介素IL-6、IL-1β 等进入脑内,最终导致脑组织损伤。这几个核心靶点与细胞凋亡信号通路、炎症反应、神经调节等相关,畅脉乐胶囊的活性成分槲皮素、山奈酸、丹参酮、木犀草素、芍药苷等明显降低大鼠脑组织TNF-α、IL-6及IL-1β 含量,抑制炎症反应［16,17］,体现了畅脉乐胶囊多靶点抗脑血栓,同一靶点又受多个化合物调控的作用特点。

通过对关键靶点进行GO 分析和KEGG 通路富集分析可知,畅脉乐胶囊主要作用于Wnt 通路、PI3KAkt 通路、MAPK 通路及脂质和动脉粥样硬化等信号通路,通过调节血管内皮功能,抑制炎症反应,促使神经功能恢复。Wnt 通路是目前研究最为广泛且较成熟的一条信号通路,在细胞增殖、分化及凋亡等阶段均有重要的作用。黄芪甲苷可通过Wnt/β-catenin 通路、Akt-mTOR 通路改善大鼠脑缺血再灌注损伤［18,19］。木犀草素、丹参酮Ⅱ等通过调节PI3K-Akt 信号通路,干预缺血性脑卒中,发挥抗炎、抑制细胞凋亡、神经保护等作用［20］。谢胜伟等［5］的研究结果显示畅脉乐胶囊可抑制Wnt 通路中关键激酶的活性,降低内皮细胞中Wnt1、β-catenin、dvl-1 的表达,改善动脉粥样硬化程度。上述已有研究与本研究结果一致,体现了畅脉乐胶囊可通过多靶点、多通路发挥对脑卒中后损伤的内皮细胞增殖、神经血管保护的调控作用。

综上所述,本研究采用UPLC-QE-MS 技术定性了畅脉乐胶囊中的主要化学成分,并结合网络药理学方法探索了畅脉乐胶囊抗脑血栓的作用机制。网络药理学的整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的“多成分、多靶点、多途径”的特点相吻合,符合中医药对疾病本质的认识,为研究传统中药与现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁。