不同葡萄品种果肉质地和细胞结构及生理指标分析

张 雯，马依努尔·加马力，王 敏，韩守安，谢 辉，潘明启*

(1 新疆农业科学院园艺作物研究所/新疆特色果蔬基因组研究与遗传改良重点实验室/农业部新疆地区果树科学观测试验站/新疆作物化学调控工程技术研究中心，乌鲁木齐 830091；2 吐鲁番市高昌区葡萄镇人民政府农技推广站，新疆吐鲁番 838000)

中国是世界最大的鲜食葡萄生产国和消费国[1,2]，目前葡萄已成为很多产区农业支柱产业，在乡村振兴中发挥着重要的作用[3]。果肉质地是果实品质的重要评价指标，不仅直接影响口感品质，同时也是果品储运特性和货架期的重要影响因素[4-6]。前人有研究认为果肉受果肉细胞结构、大小和形态等因素影响，如甜瓜果肉质地与细胞大小有关，果肉细胞越小果肉硬度越大[6]；马铃薯块茎硬度与组织细胞面积和周长显著负相关[7]；苹果的细胞圆度越大果肉硬度越高[8]，甜瓜的圆度与质构指标黏着度显著正相关[6]。同时，细胞壁成分物质和果胶酶等相关酶活性的变化也是果肉质地的重要研究方向，如琵琶果实成熟过程果肉质地变化主要与细胞壁间层果胶降解有关，不同果肉质地品种之间成熟期水溶性果胶(WSP)含量及多聚半乳糖醛酸酶(PG)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)等果胶降解酶活性存在显著差异[9]；苹果果实细胞壁WSP含量与果肉脆度呈负相关关系[10]。传统上通常采用感官评价(品尝)的方法对果实质地进行评价，但往往存在易受人为因素干扰、难以量化等缺陷和不足[11]。质地剖面分析(TPA)等仪器分析法，可获得大量与果肉质地相关的量化数据，且具有稳定性好、重复性高等诸多优点，近年来逐渐应用在园艺作物果实质地评价过程中[12]。

目前有关葡萄果肉质地的研究主要集中在果实成熟过程中果肉软化原因分析及采后贮藏保鲜过程中质构特性变化等方面，有关不同葡萄品种果肉质地成因生理基础分析方面的研究较少。因此，本研究以质地存在明显差异的12个葡萄品种为试材，比较分析不同品种葡萄果肉TPA参数、细胞壁成分物质含量、果胶、纤维素代谢酶类活性、细胞结构和形态参数的差异及其相关关系，以期为葡萄果实品质调控技术的研发提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究以国家葡萄产业技术体系果实品质调控岗位核心试验基地内(新疆乌鲁木齐市，新疆农业科学院安宁渠综合试验场)口感质地存在明显差异的12个葡萄品种为试材，品种信息详见表1，果穗形态见图1，于果实成熟期，分别取样进行果肉质地评价、细胞壁结构物质、关键酶活性及组织细胞结构分析。

表1 试验材料

图1 供试葡萄品种果穗形态Fig.1 The ear morphology of studied grape varieties

1.2 测定指标及方法

1.2.1 果肉质地感官评定对12葡萄品种果肉质地进行感官评价，分为1～5级，级数越高，口感越硬。1.2.2 质构指标(TPA) 取果实赤道处果肉材料(带皮和去皮2种)，采用TA.XT. Plus物性分析仪(英国Stable Micro System公司)进行测定，每个品种重复10次。将准备好的果肉样品置于平板上采用P/75柱头(φ75 mm压板)进行测定。前速度5 mm/s，测试速度1 mm/s，测后上行速度1 mm/s，葡萄果肉受压变形为30%，两次压缩停顿时间为5 s，触发力为5 g[13]。通过质地特征曲线得到硬度、弹性、黏着性、胶着度、咀嚼性、回复性等指标。

1.2.3 细胞壁结构物质及关键酶活性成熟期采集新鲜果实，擦拭干净后，去除种子，取果实中部带皮果肉组织液氮速冻后-80 ℃保存待测。使用ELISA(酶联免疫)试剂盒对水溶性果胶(WSP)、原果胶(PP)、纤维素等细胞壁结构物质含量进行测定，进一步计算WSP/PP和总果胶含量；使用ELISA试剂盒对多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲酯酶(PEP)、果胶裂解酶(PL)和纤维素酶(CE)活性进行测定。

1.2.4 果肉组织细胞形态观察选取果实赤道处带皮果肉组织，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小组织块，使用50%酒精FAA固定液固定，酒精梯度脱水，石蜡包埋，番红-固绿染色，切片观察组织细胞结构[14]。

1.3 数据统计分析

用ImageJ软件对果肉组织切片进行图像分析，获得细胞形态学参数；用SAS软件对数据进行方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同葡萄品种果肉质地比较

2.1.1 果肉质地评级通过感官品尝评价可以将12个葡萄品种分成硬、脆、酥脆、中等和软5种果肉质地类型，质地评级赋分依次为5、4、3、2、1级(表1)。其中，‘维多利亚’、‘克瑞森’和‘红地球’3个品种评价属于硬肉类型，为5级；‘木纳格’、‘火焰无核’和‘夏黑无核’3个品种评价属于脆肉类型，4级；‘里扎玛特’评价属于酥脆类型，为3级；‘无核白鸡心’、‘无核紫’、‘火州黑玉’和‘无核白’4个品种评价属于中等类型，为2级；‘京亚’评价属于软肉类型，为1级。

2.1.2 果实质构指标不同葡萄品种果实带皮质构指标存在较大差异(表2)。果实的TPA硬度在12个葡萄品种间变化最大，分布在672.44～2 463.52 g范围内，变异系数(CV)达到45.12%，其中果肉脆或者酥脆品种 ‘木纳格’、‘火焰无核’和‘里扎玛特’3个品种硬度显著高于其他品种；各葡萄品种间果实胶着度和咀嚼性变化次之，分别分布在296.02～943.42和220.33～731.53 g范围内，CV分别达到36.97%和33.22%，均以果肉较硬的品种‘维多利亚’显著高于其他品种；各葡萄品种间果实弹性、黏着性和回复性变化相对较小，分别分布在0.63～0.91 mm、0.30～0.57 g·s和0.13～0.26 g范围内，CV分别为9.41%、17.80%和18.39%，其中果肉较脆的‘夏黑无核’均显著高于其他品种。

同时，葡萄果实去皮后各项质构指标均比带皮测定结果不同程度降低(表2)。其中，各项质构指标仍以果实TPA硬度在12个葡萄品种间变化幅度，分布在202.95～2 306.82 g范围内，变异系数达到75.16%，其中果肉较脆的‘木纳格’显著高于其他品种；各葡萄品种间果实的胶着度和咀嚼性变化幅度次之，分别分布在47.14～571.03和16.57～300.27 g范围内，CV分别达到65.57%和65.25%，果肉较脆的‘木纳格’胶着度显著高于其他品种，软肉品种‘京亚’的胶着度显著低于其他品种，果肉酥脆的‘里扎玛特’咀嚼性显著高于其他品种；各葡萄品种间果实的回复性分布在0.08～0.20 g范围内，CV为25.06%，果肉质地中等的‘火州黑玉’显著高于其他品种，软肉品种‘京亚’显著低于其他品种；果实弹性和黏着性在各品种间差异较小，分别分布在0.35～0.61 mm和0.22～0.42 g·s范围内，CV分别达到15.49%和15.08%，其中果肉质地中等的‘火州黑玉’均显著高于其他品种。

表2 不同品种葡萄果实质地特性

2.1.3 果肉质地评级及其与果实质构指标的相关性葡萄果实带皮测定质构指标与果肉质地评级指标的相关分析结果(图2，A)表明，果肉质地评级指标与带皮测定TPA硬度、弹性、黏着性、胶着度、咀嚼性、回复性等质构指标的相关性均达到显著或极显著水平，其中与硬度、胶着度和咀嚼性3个指标的相关系数最高，分别达到0.578*、0.751**和0.789**。同时，葡萄果实去皮测定质构指标与果肉质地评级指标的相关结果(图2，B)显示，果肉质地评级指标与去皮测定的6项质构指标的相关性也均达到显著或极显著水平，并同样与硬度、胶着度和咀嚼性3个指标的相关系数最高，分别达到0.519*、0.569**和0.549**。

TPA-1至TPA-6分别为硬度、弹性、黏着性、胶着度、咀嚼性、回复性等质构指标，Degree为果肉质地分级系数。*代表显著相关(P<0.05)，**代表极显著相关(P<0.01)图2 带皮(A)和去皮(B)葡萄果实TPA质构指标与其果肉质地评分的相关性热图TPA-1 to TPA-6 indicate the texture indexes such as hardness, elasticity, adhesiveness, stickiness, chewiness and resilience, respectively, and Degree indicates the rating coefficient of flesh texture.* indicates significant correlation (P<0.05), ** indicates significant correlation (P<0.01)Fig.2 The heat map of correlation between flesh TPA texture index measured with skin (A) and without skin (B) and texture score

2.2 不同葡萄品种果肉细胞壁结构物质及代谢关键酶活性差异

图3，A显示，不同葡萄品种果肉水溶性果胶含量分布在0.28～0.85 mg/g范围内，品种间存在较大差异，变异系数达到32.03%，其中果肉较酥脆的‘里扎玛特’显著高于其他品种，果肉较脆的‘夏黑’、软肉的‘京亚’和肉质中等的‘无核白’显著低于其他品种；果肉原果胶含量分布在0.71～2.35 mg/g范围内，变异系数达到33.44%，品种间存在显著差异，其中果肉较脆的‘火焰无核’和‘木纳格特’及果肉较硬的‘克瑞森’显著高于其他品种，软肉的‘京亚’显著低于其他品种；果肉总果胶含量分布在1.15～3.11 mg/g范围内，变异系数达到28.87%，品种间存在显著差异，其中果肉较硬的‘克瑞森’显著高于其他品种，软肉的‘京亚’显著低于其他品种。同时，不同葡萄品种果肉水溶性果胶/原果胶比值也存在显著差异，其比值分布在0.20～0.70范围内，其中果肉酥脆的‘里扎玛特’和软肉的‘京亚’显著高于其他品种，而硬肉品种‘红地球’、‘克瑞森’和‘维多利亚’显著低于其他品种(图3，B)。另外，12个葡萄品种果肉纤维素含量差异显著，其含量分布在35.73～120.75 mg/g范围内，其中脆肉的‘木纳格’和硬肉的‘红地球’显著高于其他品种，而果肉酥脆的‘里扎玛特’和硬肉的‘克瑞森’显著低于其他品种(图3，C)。

同一指标内不同小写字母表示品种间在0.05水平上有显著性差异，下同图3 不同品种葡萄果肉果胶和纤维素含量差异The different letters in the same index mean significant difference among cultivars at 0.05 level, the same as following.Fig.3 Difference of pectin and cellulose contents in flesh of different grape varieties

各葡萄品种果肉PG、PEP和PL等果胶代谢关键酶活性同样存在显著差异(图4,A)。其中，12个品种果肉PG活性分布在0.19～0.26 U/g范围内，变异系数为11.78%，‘里扎玛特’和‘火焰无核’显著高于除‘无核白’以外的其他品种；果肉PEP活性分布在0.95～1.29 U/g范围内，变异系数为10.95%，其中‘火焰无核’和‘夏黑’显著高于除‘木纳格’以外的其他品种；果肉PL活性分布在0.38～0.48 U/g范围内，变异系数为7.45%，其中‘无核白’显著高于其他品种。另外，不同葡萄品种间果肉纤维素酶活性也存在显著差异(图4，B)，其活性分布在988.15～1 319.31 U/g范围内，变异系数为9.10%，其中的‘夏黑’、‘京亚’‘无核白鸡心’明显较高，而‘克瑞森’和‘木纳格’显著低于其他品种。

PG.多聚半乳糖醛酸酶；PEP.果胶甲酯酶；PL.果胶裂解酶；CE. 纤维素酶图4 不同品种葡萄果肉果胶和纤维素代谢相关酶活性差异PG. Activities of polygalacturonase； PEP. Pectin methyl esterase; PL. Pectin lyase; CE. Cellulase Fig.4 Difference of enzyme activities related to pectin and cellulose metabolism in flesh of different grape varieties

2.3 不同葡萄品种果肉细胞形态差异

首先，不同葡萄品种果肉细胞大小存在差异(表3)。其中，12个品种果肉细胞长度分布在83.00～229.70 mm范围内，变异系数达到31.74%，其中的‘里扎玛特’、‘克瑞森’ 、‘红地球’和‘无核白鸡心’4个品种均显著高于其他品种，‘木纳格’和‘火焰无核’均显著低于其他品种；果肉细胞宽度分布在34.59～113.70 mm范围内，变异系数达到39.55%，其中‘里扎玛特’显著高于其他品种，而‘木纳格’、‘火焰无核’、‘无核紫’明显较低；果肉细胞周长分布在257.93～757.90 mm范围内，变异系数达到32.26%，其中‘里扎玛特’显著高于其他品种，‘火焰无核’显著低于其他品种。

表3 不同品种葡萄果肉细胞形态差异

其次，不同葡萄品种果肉细胞形态也存在差异(表3)。其中，果肉细胞面积分布在2 958.83～25 113.71 mm2范围内，品种变化幅度最大，变异系数达到64.91%，其中‘里扎玛特’显著高于其他品种，而‘木纳格’、‘火焰无核’、‘无核紫’和‘无核白’显著低于其他品种；细胞纵横比分布在2.10～4.82，变异系数为26.38%，其中‘克瑞森无核’显著高于其他品种；细胞越圆圆度越接近1，12个品种果肉细胞圆度分布在1.50～2.57 mm范围内，变异系数达到13.89%，其中‘克瑞森无核’显著大于其他品种，细胞呈细长型，而‘京亚’细胞圆度最小，细胞最圆。

另外， 5个不同果肉质地代表品种的细胞显微结构(图5)显示，软肉品种‘京亚’果肉细胞降解明显，细胞壁界限模糊不清；除软肉品种外，其他4个果肉质地的品种，果肉细胞均比较完整，细胞壁界限清晰可辨；酥脆果肉品种‘里扎玛特’果肉细胞明显大于其他品种。

A～E依次为品种‘克瑞森无核’(硬)、‘夏黑’(脆)、‘里扎玛特’(酥脆)、‘无核紫’(中等)和‘京亚’(软)图5 不同质地葡萄品种果肉细胞显微结构A to E indicate the Crimson seedless (hard), Summer black (crispy), Rizamat (soft crispy), Black monuckka (medium crispy) and Jingya (soft)，respectivelyFig.5 The microstructures of different flesh texture grapes

2.4 果肉质地指标与细胞壁组成物质、关键酶活性及果肉细胞形态的相关性分析

葡萄果肉4个关键酶活性、5个细胞壁结构物质指标、6个细胞形态指标与4个果肉质地指标(带皮TPA硬度、胶着度和咀嚼度、果肉质地评级)的相关性分析结果(图6)表明，果肉PG、PEP、PL和CE 4个关键酶活性，以及细胞长度、宽度、周长、面积、纵横比和圆度6个果肉细胞形态指标均与果肉质地指标的相关性未达到显著水平；果肉细胞壁结构物质原果胶含量与果肉质地评级呈显著正相关(0.679*)，水溶性果胶/原果胶与4个果肉质地指标均呈负相关关系，其中与果肉质地评级和咀嚼度的相关性分别达到极显著和显著水平(分别为-0.860***和-0.595*)，总果胶含量与TPA硬度呈显著正相关(0.643*)。依据以上相关分析结果并结合果肉细胞显微观察结果，认为葡萄果肉质地主要受果肉细胞胞间层和细胞降解影响，细胞结合越紧密、水溶性果胶/原果胶比值越低，果肉硬度越高。

图6 果肉质地指标与细胞壁组成物质、关键酶活性、细胞形态指标的关联热图Fig.6 The heat map of correlation between flesh texture index and cell wall composition, key enzyme activity and cell morphology index

3 讨 论

本研究通过对不同果肉质地葡萄浆果进行质地剖面分析(TPA)、果肉细胞壁组成物质含量测定、果胶、纤维素降解酶活性测定及果肉细胞显微结构分析，结果表明不同类型葡萄TPA质地参数存在显著差异，其中果肉质地感官评级结果与带皮测定TPA硬度、胶着度和咀嚼性等3个指标的相关性最高，可以作为葡萄果肉质地的量化评价指标。前人关于葡萄[15]、苹果[16]、梨[17]和桃[18]等果实TPA测定结果表明，硬度与咀嚼性呈显著正相关，可以较好地反映果实硬度差异，本研究结果与前人一致。但前人有关果实质地的TPA测定主要是作为储藏期间果肉质地变化的评价指标，有关TPA指标对不同果肉质地的评价研究较少。王燕霞等[11]通过对14个不同质地梨品种12个质构指标的研究结果表明硬度、破裂力和脆度3个指标可作为评价梨果肉质地评价的重要参数。

同时，本研究结果表明12个不同质地葡萄果实间果肉细胞壁原果胶、水溶性果胶、纤维素含量及水溶性果胶/原果胶等指标存在较大差异，其中果实原果胶含量与果肉质地评分显著正相关，水溶性果胶/原果胶比值与果肉质地评分和咀嚼性显著负相关，反映出葡萄果肉质地的形成受细胞壁物质代谢影响；黄志明等[19]认为不同质地类型琵琶果肉软化主要是由果胶、纤维素、半纤维素等细胞壁组分发生降解，果肉细胞趋于分散引起的，高欢欢等[9]进一步证实WSP含量以及PG和β-Gal 活性差异是导致枇杷果肉质地差异形成的生理因素；潘好斌等[20]关于薄皮甜瓜果肉质地的研究也得出相似的结果，认为水溶性果胶含量与果肉硬度呈显著负相关；Konstankiewicz K等[7]研究认为水溶性果胶、离子型果胶及纤维素含量差异是苹果质地差异的关键因子，本研究结果与前人的相关研究结果一致。

另外，前人有关苹果果肉[8,21]、土豆块茎[7]、甜瓜果肉[6]质地与细胞结构关系的研究结果表明，细胞大小与硬度密切相关，果肉细胞越大硬度越小；苹果果肉细胞圆度越大果肉硬度越高[8，22]，甜瓜果肉细胞圆度与质构指标黏着度显著正相关[6]，近圆形细胞越多果肉脆度越高。本研究结果表明12个不同质地葡萄品种果肉细胞圆度与其质地评分、TPA硬度、胶着度和咀嚼性等质构指标均呈正相关关系，但显著性均未达到显著水平，这与前人关于苹果质地的研究结论类似。李红光等[23]研究认为瑞阳和富士苹果口感质地显著优于秦冠苹果，与其果肉细胞面积较大、排列整齐有关。本研究通过对不同葡萄品种果肉细胞周长、面积等参数的测定与分析发现，葡萄果肉酥脆特性与细胞大小密切相关，酥脆品种‘里扎玛特’果肉细胞周长、面积显著大于其他品种，这与前人研究结果类似。前人研究认为猕猴桃、草莓等浆果类果肉质地的软化与果肉组织溶质化，即果实组织细胞个体的崩裂、消融溶解形成均一态胶体的过程有关[24]。本研究在软肉葡萄品种‘京亚’上也观察到类似的现象，软肉品种果肉细胞完全降解，细胞形态难以辨认，与前人研究结果类似。但本研究的葡萄品种中酥脆质地和软肉质地品种较少，无法从统计学角度进行分析，今后还需加强对酥脆和软肉质地品种的研究来验证本文结论。