天然PAK1抑制剂抵御SARS-CoV-2感染的潜力

周 华

（安徽医学高等专科学校生理教研室，安徽 合肥 230601）

冠状病毒是大型包膜RNA 病毒，可引起人类广泛的呼吸系统疾病，包括自愈性上呼吸道感染和严重的肺炎。目前已经确定了7种感染人类的冠状病毒，称为人类冠状病毒（Human coronavirus，CoVh）。包括α冠状病毒，分别为229E和NL63；β冠状病毒，分 别 为OC43、HKU1、SARS-CoV、SARS-CoV-2 和MERS-CoV。新型冠状病毒肺炎（Corona virus dis‐ease 2019，COVID-19）是一种由SARS-CoV-2引起的传染性疾病，呼吸系统是其主要靶点，引起肺损伤和功能障碍，导致致命性肺炎，其主要临床症状有发烧、咳嗽、肌痛、疲劳、腹泻等，严重者表现为急性肺损伤（Acute lung injury，ALT）、急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）、呼吸衰竭、心力衰竭、脓毒症、心脏骤停等［1］。COVID-19 持续流行主要通过咳嗽或打喷嚏产生的飞沫或直接与受感染个体接触而在人与人之间发生传播。各国为了控制COVID-19 大流行采取了一些预防措施，例如隔离和城市封锁等。但是，这些措施不足以控制SARS-CoV-2 在某些地区传播，严重威胁全球范围内的公共卫生，给人类健康和世界经济发展造成极大影响。特定有效的疫苗是结束这一致命大流行的最佳方法，但需要长时间地准备及临床试验，因此目前迫切需要有效的预防/治疗药物应对SARS-CoV-2的快速传播。

已有很多科研团队在探索冠状病毒的遗传密码以及由SARS-CoV-2 导致机体损伤的潜在机制，以帮助寻找潜在的靶点和/或治疗药物，从而使病毒失活并降低其破坏性。有文献报道［2］，p21活化激酶（p21-activated kinases，PAKs）是几种重要致病性人类病毒（如HIV、HBV、SARS-CoV 等）生命周期的核心，PAKs通过调节许多细胞生物学过程影响病毒进入、繁殖和出口，这些致病性病毒可以利用PAKs 功能来获取细胞并影响功能。因此推测抑制PAKs 功能可作为一种新的抗病毒治疗靶点。

1 PAKs

1994 年，发现哺乳动物体内存在PAKs，在过去的十年中，PAKs因其涉及对多种细胞功能的调节而在医学上获得了极大的关注。PAKs 是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族，是小GTP 酶CDC42 和RAC的下游效应器，位于几个信号通路的交汇口，在细胞生长、细胞存活、细胞骨架、细胞迁移和细胞形态中起着核心作用。迄今为止，在哺乳动物细胞中已发现了6个PAKs家族成员，并根据其结构和功能相似性分为Ⅰ组（PAK1～PAK3）和Ⅱ组（PAK4～PAK6）［3］。

PAKs 功能异常已被证明涉及影响人类健康的3 个重要领域，即癌症、脑功能和病毒感染，其中PAK1 是主要的“致病”激酶，PAK1 过度激活与多种疾病有关，如衰老、炎症、疟疾、癌症、病毒感染等［4］。研究发现，一种缺乏PAK1 的秀丽隐杆线虫突变体的寿命比野生型长60%，说明即使是正常水平的PAK1 也足以缩短机体寿命［5］。另外，PAK1 参与多种癌症生长和/或转移，包括脑癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌/直肠癌、肝癌和胰腺癌；PAK1 还涉及胰腺癌、结肠癌和肺癌的治疗抵抗，PAK1 现在被认为是治疗不同类型癌症的主要治疗靶点［6］，且已有证据表明，PAK1 是一个安全的治疗靶点，HUYNH N 等发现抑制PAK1 表达不仅可以抑制肠道肿瘤的进展，还可以通过上调免疫系统来刺激机体免疫反应［7］。

2 PAK1在病毒感染中的潜在作用

致病性人类病毒感染细胞进行复制和传播，必须利用宿主的信号机制。大量的宿主信号蛋白参与这些过程，但最新研究表明几个进化上不同的病毒家族成员在其复制周期的一个或多个阶段都有与PAKs 相互作用，且绝大多数这些相互作用促进病毒复制、传播和/或免疫逃避［8］。

CHANG H等发现，在血吸虫感染期间，PAK1过度表达与严重的肝脏病理学有关［9］。CD4+T 细胞不同的亚集群包括：Th1、Th2、Th17 和Treg，它们对宿主防御病原体感染和炎症性疾病时的免疫反应至关重要。PAK1 通过诱导巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-6，进而激活抗原呈递细胞（Antigen-presen‐tiong cells，APC）促使CD4+T细胞向Th17细胞分化，抑制其向Treg 细胞分化，从而进一步促进肝脏肉芽肿和肝脏纤维化的发展。而且，PAK1 缺失可上调Treg 细胞，在血吸虫感染期间，能减弱局部炎症反应，改善感染期间肝脏免疫病理学发展。

人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）是一种慢病毒，属于逆转录病毒亚群。HIV 感染会导致机体免疫细胞遭到破坏，从而导致机体对多种感染和疾病的易感性。HIV在感染过程中会激活宿主细胞中的PAK1，PAK1 抑制T 细胞发育/迁移、T 细胞受体信号转导和B 细胞免疫球蛋白同型转换，从而引起机体免疫系统抑制或缺陷，增强病毒感染。因此推测抑制PAK1 可对抗病毒感染，上调免疫系统并逆转免疫系统的缺陷［10］。

最新研究表明，PAK1 也参与了由冠状病毒引起的肺纤维化/肺炎症的发展［11］。血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）已被证明是SARS-CoV-2 进入宿主靶细胞的功能受体。SARS-CoV-2 通过病毒刺突蛋白（S 蛋白）与细胞膜上ACE2 结合，附着于靶细胞上，后在细胞表面蛋白酶TMPRSS2介导下，病毒与细胞膜融合通过入胞的方式进入细胞内，导致病毒在靶细胞内复制，病毒通过激活酪蛋白激酶Ⅱ（Casein kinaseII，CKⅡ）介导ACE2 磷酸化，诱导ACE2 下游的CKII/RASPAK1-RAF-AP1信号传导通路引起PAK1过度激活，导致AP-1 生成增加。AP-1 被认为是CCL2 的主要转录激活因子，AP-1 涉及SARS-CoV-2 诱导的CCL2表达增加，导致COVID-19 患者肺部炎症、肺纤维化［12］。

CKⅡ是一种普遍表达的蛋白激酶，生理状态下调节多种生物过程，包括细胞生长和存活、基因表达和肌动蛋白细胞骨架。研究也发现，CKⅡ在癌细胞中过度表达，它通过调节肿瘤抑制因子的稳定性和/或活性以及通过维持多个细胞存活信号通路来促进肿瘤发生。SHIN Y J 等发现CKⅡ激酶在调节PAK1 活性中也发挥着关键作用，它通过磷酸化PAK1，使PAK1 构象发生改变，使其从无活性的非二聚体转变为有活性的单体，从而激活PAK1［13］。

CCL2 被称为单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），属于CC 趋化因子家族，它是一种有效的单核细胞趋化因子，可吸引单核细胞、记忆T淋巴细胞和嗜碱性粒细胞，参与许多生物过程，包括炎症、血管生成和凝血。它的合成是由炎症过程中损伤部位诱导的，通过指导先天免疫细胞，包括单核细胞/巨噬细胞在感染和损伤部位迁移和浸润，这些细胞可以通过表达组织因子（Tissue factor，TF）进而激活凝血级联反应。凝血因子通过与免疫细胞上的蛋白酶激活受体相互作用而参与炎症和抗炎反应，炎症和凝血之间的复杂串扰被称为血栓性炎症。对由冠状病毒引起的ARDS的研究已经证实了CCL2 在急性肺损伤的病理生理学中的重要性，它与感染SARS-CoV-2 后机体血栓炎性事件有关，并在最严重形式的呼吸衰竭的发病机制中发挥相关作用，这些炎性事件和肺浸润是导致COVID-19 患者进行性呼吸衰竭和死亡的主要原因［14］。在COVID-19 患者中观察到CCL2 水平升高，CCL2 与凝血级联反应的紊乱/呼吸损伤严重程度密切相关，高水平的CCL2 已被认为是COVID-19 的潜在预后标志物［15］。

另有文献报道，与轻症患者相比，重症COVID-19患者的血清中促炎细胞因子（IL-6、IL-1和TNF-α）水平更高。SARS-CoV-2 感染导致PAK1 在肺组织中过度表达，它是细胞因子风暴的关键介质，细胞因子风暴已被证明是SARS-CoV-2 感染重症患者主要的死亡原因［16］。过度炎症、免疫系统抑制和激活细胞因子风暴促进COVID-19 的发病机制，PAK1 过度激活均涉及其中，表明抑制PAK1 激活理论上可用于抵御SARS-CoV-2 感染，且PAK1 对细胞正常生长并不重要［17］，因此高度特异性的PAK1 抑制剂不会引起严重的不良反应。

3 PAK1 抑制剂——抗SARS-CoV-2 感染的新治疗靶点

SARS-CoV-2 属于单链RNA 病毒，而RNA 病毒需要依赖RNA 的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP）来进行复制，理论上，COVID-19大流行可以通过一系列RDRP 抑制剂有效地治疗，瑞德西韦（Remdesivir）是一种RDRP抑制剂，自2019年开发以来，主要用于治疗流感和埃博拉病毒，美国食品和药物管理局授权紧急使用瑞德西韦治疗COVID-19重症病例［18］，但它同时也会抑制许多其他依赖ATP 的酶，例如蛋白激酶和伴侣蛋白等，从而导致许多不良反应。因此，选择针对性的药物，针对病毒感染所必需的特定酶，减少药物的不良反应，是抵御SARS-CoV-2 感染的理想选择。如前所述，PAK1 是“致病的激酶”，它是疟疾和病毒感染的重要组成部分。目前已证明PAK1 激活可导致肺纤维化，是COVID-19 中病情加重的主要因素。因此，MARUTA H 等认为在控制COVID-19 的靶标中，主要的“致病性”激酶PAK1 是关键［19］。另外，机体在正常情况下，人类的免疫系统通常可产生一系列针对病毒的特异性抗体，B 细胞和T 细胞是产生针对病毒和其他入侵者的特异性抗体的淋巴细胞，而PAK1 水平升高抑制B 细胞和T 细胞免疫系统，抑制适应性免疫反应，从而促进病毒复制，因此抑制PAK1可以促进免疫系统产生抗病毒抗体，帮助机体抵抗病毒并恢复正常的免疫反应。故PAK1 可作为一个抗SARS-CoV-2感染的有吸引力的药物靶点。

已有资料显示，一种可抑制肿瘤的磷酸酶PTEN可使PAK1 失活，从而抑制冠状病毒诱导的CCL2 依赖的肺纤维化（肺部炎症）［20］。氯喹（Chloroquine，CQ），一种实验用的抗疟疾药物。研究发现，它可通过上调p21 的表达抑制细胞SARS/冠状病毒感染，p21 是细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）抑制剂，p21 的表达受到PAK1 抑制［21］。SHAHINOZZAMAN M 等研究发现阿特匹林C（3，5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid，ARC）、香豆酸的异戊二烯化衍生物，是巴西绿蜂胶的主要生物活性酚类成分之一，ARC 具有较强的抗氧化、抗菌、抗炎、抗糖尿病、神经保护、胃保护、免疫调节和抗癌作用，其作用机制是诱导凋亡和抑制PAK1，而PAK1 是一种涉及包括COVID-19 感染在内的许多人类疾病/病症为特征的蛋白质，因此认为有必要对ARC 进行进一步的临床前和临床研究，以探索其干预各种疾病的潜力，包括最近的冠状病毒感染［22］。

4 天然PAK1抑制剂

由于病毒可以迅速变化，因而开发的疫苗和靶向抗病毒药物的功效，使病毒对机体的影响可能会有很大差异，包括对免疫系统的影响。因此，开发任何可以更广泛地限制病毒影响的物质非常重要，使用或开发更通用的抗病毒药物是一项重大挑战。

如前所述，PAK1 可作为一个抗SARS-CoV-2 感染的有吸引力的药物靶点。开发PAK1 抑制剂也一直是临床应用的重点，但在过去几年，PAK1 抑制剂仅作为实验室试剂使用，因其水溶性差或细胞通透性差，在临床上应用较少。

自然资源代表了最古老的药房，含有许多神奇的药物，几千年来一直是药品的来源。自人类进化以来，大自然一直是治愈疾病的源头，大自然也正在不断促进人类生物医学研究和技术的发展。一些细菌或植物会产生多种PAK1抑制剂（抗生素或植物疗法），它们可能对治疗PAK1依赖性疾病有用，从而延长健康寿命。市场上存在一些容易获得的、天然的PAK1抑制剂，具有较高的细胞通透性，或可作为“替代”或“非常规”快速广谱治疗COVID-19 和抵御SARS-CoV-2感染的分子靶点药物。

4.1 蜂胶（propolis） 蜂胶是天然的宝藏，它是一种天然的抗生素，是由觅食的蜜蜂从不同植物种类的芽和渗出物中收集的树脂物质，与蜜蜂唾液中的β-糖苷酶混合，加入蜂蜡形成生蜂胶。冷却时硬而像蜡，但温暖时非常黏，以密封蜂巢中的洞和裂缝，光滑蜂巢的内表面，减少水分流失，保护它们免受微生物感染［23］。古埃及时代以来，它作为一种传统药物已经使用了4 000 多年，具有抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗炎、保肝及免疫调节等作用，已广泛用于食品和化妆品行业中［24］。“pro”代表保护（Protection），“polis”代表蜂巢或城市。蜜蜂从植物中收集的防御物质包括苯酚和萜类化合物，其中有望抑制人类冠状病毒的植物化学物质包括槲皮素、杨梅素和咖啡酸等。蜜蜂有选择地收集和加工这些植物产品来制造蜂胶，用来保护蜂群。蜂群中能产生更多蜂胶的蜜蜂更健康、寿命更长，且蜜蜂食用蜂胶增加了它们对细菌侵袭的免疫反应。

研究证实，PAK1 由RAC 激活，蜂胶成分咖啡酸及其酯（Caffeic acid and its ester，CAPE）可以使RAC失活，从而可以抑制PAK1，而PAK1 或其上游的失活会潜在地减弱冠状病毒的发病机理［25］。

蜂胶中的成分因产地植物不同而有差异，欧洲和亚洲温带地区的蜂胶通常由蜜蜂从白杨树中收集的树脂制成，主要含有类黄酮化合物；巴西特有绿色蜂胶，来源于Baccharis dracunculifolia，主要含有各种类黄酮和烯丙基苯丙烷（如Artepellin C）。成分虽有差异，但蜂胶的这些成分均可使PAK1 失活，是有效的PAK1抑制剂［26］。

蜂胶具有与SARS-CoV-2感染相关的特性，例如强化免疫系统减少病毒复制和抗炎作用等。有足够的证据表明蜂胶和/或其成分能干扰病毒复制和感染力，由于其抗炎特性，可减少肺部炎症，同时促进免疫系统的强化，这些均可以帮助减轻COVID-19症状和有害影响。

蜂胶的安全性、低成本及对健康的益处，都说明它可成为抵御SARS-CoV-2 感染的有趣支持疗法。而且，蜂胶被认为是安全的免疫刺激剂和有效的疫苗佐剂，可诱导更早的免疫反应并提供更长的保护期，LIMA W G 等发现蜂胶在针对犬冠状病毒的疫苗中产生了积极的辅助作用［27］。

4.2 褪黑素（Melatonin） 褪黑素是一种在昼夜循环的黑夜时期中由松果体合成和分泌的多功能激素，是具有一系列促进健康特性的生物活性分子，它具有抗氧化、抗炎、抗兴奋、睡眠启动和免疫调节等多种特性，还可有效地治疗睡眠障碍、心血管疾病、眼部疾病和其他疾病等。昼夜节律的紊乱会干扰夜间褪黑素的产生，从而导致细胞功能损伤和内环境稳态失衡，诱导疾病的产生。

褪黑素具有抗病毒作用，在人类和植物的病毒感染病例中表现出有效的抑制病理表现作用。它作为一种抗氧化和抗炎剂，可以对抗病毒和细菌感染引起的急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。褪黑素不是杀病毒的，但由于其抗炎、抗氧化和增强免疫的特性，使其具有间接的抗病毒作用。如：在中枢神经系统被病毒感染（如脑炎）的小鼠中，使用褪黑素可减少病毒血症、麻痹和死亡并降低病毒载体数；在呼吸道合胞病毒模型中，褪黑素能缓解急性肺氧化损伤、下调促炎细胞因子释放和炎症细胞募集，这些发现支持褪黑素用于病毒性疾病的基本原理［28］。

文献报道［29］，血液中褪黑素水平随着年龄的增长而持续下降，在儿童和青年时期水平最高，在老年人中水平最低，是老年人睡眠质量恶化的原因。维持老年人、糖尿病和肥胖者正常水平的褪黑素水平是加强身体防御系统和免疫系统的重要策略。这解释了老年人感染SARS-CoV-2 的数量高于年轻人的原因，且老年人感染的数量、易感性和COVID-19 症状的严重程度相匹配。临床数据也证实褪黑素在缓解由病毒、细菌、辐射等引起的急性呼吸疾病方面起积极作用；褪黑素可通过降低血管通透性、焦虑和改善睡眠质量，对COVID-19重症监护患者有效［30］。

褪黑素在人体中的安全性非常高。短期使用褪黑素是安全的，即使是高剂量使用，报道的不良反应也仅限于偶尔出现的头晕、头痛、恶心和困倦；在ALI/ARDS 动物研究中使用褪黑素后也没有记录到不良反应。因此，尽管褪黑素在COVID-19 中应用的直接证据尚不清楚，但它在实验动物模型和人类研究中的有效性和安全性，可以预见，它被COVID-19患者使用将是非常有益的［31］。

褪黑素研究的先驱者最近强调褪黑素在睡眠障碍、免疫系统效能降低、传染病、炎症、癌症、疼痛等异常情况下具有重要的抗PAK1 特性，可以作为替代或佐剂纳入COVID-19的治疗［30］。

综上所述，为了尽快解决COVID-19 给全球人类健康和世界经济发展造成极大影响，迫切需要找到有前途的治疗COVID-19 疾病的药物。各种证据表明，“致病性”激酶PAK1 与SARS-CoV-2 感染后发病机制有关，直接或于其上游抑制PAK1 可潜在阻断SARS-CoV-2 感染或发病。在临床中使用PAK1抑制剂将异常激活的PAK1 降低到PAK1 依赖性疾病患者的“正常”水平，而非“0”水平，不会产生严重的不良反应。