NTRK基因融合与肿瘤的发生及相关诊疗的研究进展

秦浩仁 杨向红

(中国医科大学附属盛京医院病理科，辽宁 沈阳 110004)

自1986年在结直肠癌组织中首次发现神经营养因子酪氨酸受体激酶(NTRK)基因融合以来[1],NTRK基因融合作为原肌球蛋白受体激酶(TRK)致癌激活最常见的驱动因素[2]，导致了许多不同组织学类型成人和儿童肿瘤的发生。NTRK基因融合在一些罕见的肿瘤，如婴儿型纤维肉瘤(IFS)、先天性中胚层肾瘤(CMN)(细胞型)、分泌型乳腺癌(SBC)、乳腺样分泌性癌(MASC)中发生率极高，甚至可作为其特征性改变，而在一些常见的肿瘤类型中发生率较低。目前针对NTRK基因融合的检测手段有免疫组织化学法(IHC)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)、基于DNA和RNA的高通量二代测序(NGS)，每种检测方法都有各自的优点和局限性，结合肿瘤的组织学类型，合理利用每种检测方法的特点，制定检测策略，可以提高其阳性检出率。针对NTRK基因融合的靶向治疗，第一代TRK酪氨酸激酶抑制剂Larotrectinib和Enrectinib已分别于2018与2019年在美国、日本及欧洲等地批准上市，用于治疗局部晚期、远处转移的NTRK基因融合阳性成人和儿童肿瘤患者。针对第一代抑制剂使用后出现的靶向耐药突变，第二代TRK抑制剂Selitrectinib(LOXO-195)和Re-potrectinib(TPX-0005)也已经被设计出来，在临床前试验中展现出了比第一代抑制剂更强的活性，由此也产生了TRK抑制剂的序贯疗法。目前有关这两种药物的临床试验还在进行中。本文将从TRK蛋白的生理与功能、NTRK基因融合与肿瘤发生、NTRK基因融合的检测、NTRK基因融合的靶向治疗4个方面进行梳理阐述。

1 TRK蛋白的生理与功能

1.1 TRK蛋白的结构

TRK蛋白来自单跨膜受体型酪氨酸蛋白激酶家族，家族成员包括TRKA、TRKB、TRKC，分别由NTRK1、NTRK2以及NTRK3编码。NTRK1位于染色体1q23.1，转录出含有开放阅读框(ORF)的转录本4种，其中典型的TRKA含有796个氨基酸[3]。NTRK2位于染色体9q21.33，转录出含有ORF的转录本8种，其中典型的TRKB含有822个氨基酸。NTRK3位于染色体15q25.3，转录出含有ORF的转录本14种，其中典型的TRKC含有839个氨基酸。TRK蛋白由胞外配体结合区、中间跨膜区和含有酪氨酸激酶催化结构域的胞内区构成，胞外的结构域依次是1个富含半胱氨酸的簇(C1)，3个富含亮氨酸的重复序列(LRR1-3)，1个富含半胱氨酸的簇(C2),2个免疫球蛋白样的结构域(Ig1、Ig2),其中LRR1-3模体是TRK蛋白所特有的[2]，胞内区含有5个主要的酪氨酸残基，其中中间3个酪氨酸残基(TRKA的Y676、Y680、Y681，TRKB的Y718、Y722、Y723，TRKC的Y705、Y709、Y710)位于激酶结构域的活化环上，是激酶活化所必需的，另外2个位于激酶结构域的两侧(TRKA的Y496、Y791，TRKB的Y532、Y833，TRKC的Y516以及Y834)，作为一些连接蛋白和酶的结合位点。

1.2 TRK蛋白的配体及信号通路

神经生长因子(NGF)作为配体与TRKA高亲和力结合，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子4(NF-4)分别作为配体与TRKB高亲和力结合，NF-3作为配体与TRKC高亲和力结合，NF-3能与所有TRK蛋白结合，但是与TRKC的亲和力最高。配体主要与相应TRK受体的Ig2结构域结合(TRKB与BDNF、NF-3结合时除了Ig2也需要Ig1结构域的参与[4])，形成TRK二聚体，TRK蛋白构象改变引起激酶活性增强，使活化环内的酪氨酸残基(TRKA的Y676、Y680、Y681或者TRKB、TRKC相应位置残基)发生自我磷酸化，从而导致激酶完全活化，再引起TRKA的Y496、Y791或者TRKB、TRKC相应位置的残基磷酸化，其作为连接蛋白和酶的结合位点分别与相应的蛋白结合，驱动下游通路，其中TRKA的Y496、TRKB的Y532、TRKC的Y516与连接蛋白SHC和FRS2结合，驱动RAS/ERK通路及PI3-K/AKT通路，TRKA的Y791、TRKB的Y833、TRKC的Y834与PLCγ结合，驱动IP3-Ca2+/DAG-PKC通路，调控细胞核内相关基因的转录、参与神经元分化与存活、细胞的增殖、突触形成与可塑性等过程[2,5-6]。值得注意的是，上述3条通路是主要的信号通路，但是也存在着一些不依赖于Y496、Y532、Y516位点相互作用的信号通路，故关于TRK信号通路需进一步研究[2]。

1.3 TRK蛋白的作用

TRK蛋白主要在神经组织中表达，在胚胎发育和神经系统正常功能中发挥重要作用。TRKA可以在背根和三叉神经节中的痛觉神经元中表达[7-8]，TRKB在结状神经节和岩神经节的神经元中表达，TRKC则在背根神经节中的本体感觉神经元中表达[9]，从而参与这些感觉神经节中神经元的分化与存活。TRK蛋白在记忆、疼痛感觉、本体感觉等方面起作用。具体来说，TRKA主要与疼痛感知有关，NTRK1基因突变可以引起先天性对疼痛不敏感伴无汗症[10]；TRKB主要与能量平衡、摄食、学习、记忆、运动行为、疼痛感觉等有关，NTRK2基因突变可以导致能量失衡、摄食增加、肥胖和发育滞后[11]。TRKC蛋白主要与本体感觉有关，除了在神经系统中发挥作用外，也在心血管系统、卵巢、免疫系统中发挥作用[2，6]，值得一提的是TRK蛋白还在平滑肌细胞中有表达。

2 NTRK基因融合与肿瘤发生

虽然在一些肿瘤中可以检测到NTRK基因突变、TRK剪接体变异、TRK过表达等分子改变，但是NTRK基因融合是TRK蛋白致癌激活的最常见的机制[2]。通过对TRK蛋白的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的临床前和临床研究，证实了NTRK基因融合是许多成人和儿童肿瘤的致癌驱动因素。另外值得注意的是，NTRK基因融合与信号通路中一些驱动因子的致癌改变(例如BRAFV600E基因突变、KRAS基因突变、NRAS基因突变、EGFR基因突变、ALK基因融合、ROS1基因融合等)相互排斥[12-13]。虽然总体上NTRK基因融合发生率在所有实体肿瘤中占1%左右，但是在一些罕见肿瘤中发生率高达90%以上。

2.1 NTRK基因融合机制

含有激酶结构域的NTRK基因3′端和其上游伴侣基因的5′端通过染色体内或染色体间重排的方式连在一起形成融合基因，在上游伴侣基因的启动子驱动下开始转录，最终翻译出NTRK基因的嵌合蛋白。嵌合蛋白的碳端含有完整的TRK激酶结构域，氮端一般含有来自上游伴侣的一个或多个可以介导二聚化的结构域(卷曲螺旋结构域、锌指结构域、WD结构域、Pointed结构域等)[2，12]，嵌合蛋白这种结构可以导致其不依赖于配体的二聚化，从而激活碳端TRK激酶结构域，驱动下游通路，诱导细胞存活、增殖，致肿瘤发生。目前在肿瘤中发现的NTRK基因上游5′端的伴侣基因多达80多种[3]。

2.2 NTRK基因融合发生频率

根据NTRK基因融合在肿瘤中发生的频率，可以将肿瘤分为2类[2]：第一类是高度富集NTRK基因融合且发生频率高达90%以上的罕见肿瘤，包括IFS、CMN(细胞型)、SBC、MASC 4种。在这4类肿瘤中，融合类型主要是ETS变异转录因子6(ETV6)-NTRK3融合，这种基因改变可以作为这4种肿瘤的诊断要点[2，6]；第二类是NTRK基因融合发生频率在25%以下的一些常见肿瘤，包括甲状腺癌、结直肠癌、肺癌、肉瘤、中枢神经系统肿瘤、黑色素瘤、Spitz样肿瘤、乳腺癌、胆管癌、胃肠道间质瘤、胰腺癌等实体瘤以及急性髓系白血病和急性淋巴系白血病等血液系统肿瘤[14]，上述肿瘤中具体融合类型以NTRK1、NTRK3融合为主。

3 NTRK基因融合的检测方法

3.1 FISH检测

FISH是在DNA水平上检测甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织样本中染色体重排的方法。ETV6-NTRK3融合在上述IFS、CMN(细胞型)、SBC及MASC 4种罕见肿瘤中高度富集，使用ETV6商品化分离探针检测ETV6-NTRK3融合十分有效。一般在实验室中可以使用研究者已经设计好的或者商品化的NTRK1、NTRK2、NTRK3分离探针来进行NTRK基因融合的检测，但是对于融合类型未知的肿瘤来说，分离信号阳性并不能确定伴侣基因类型以及具体融合方式(伴侣基因-NTRK还是NTRK-伴侣基因)。FISH是在DNA水平上检测是否发生基因断裂、染色体重排，因此即使信号阳性也无法确定这种NTRK基因的重排是否发生嵌合转录及表达。

3.2 RT-PCR检测

RT-PCR是在RNA水平上对融合转录本进行检测，需要分别对断裂点上游的邻近外显子和断裂点下游的邻近外显子设计引物，因此该检测前提条件是已知NTRK具体基因类型和上游具体的伴侣基因以及二者基因相应的断裂位点。有研究针对25例MASC患者应用标准RT-PCR检测ETV6基因5号外显子-NTRK3基因15号外显子这一经典型融合转录本，发现均未检出，反而用更加灵敏的巢式RT-PCR检出4例经典型；另外通过标准RT-PCR和(或)巢式RT-PCR均检出5例患者具有非典型外显子4-外显子14或外显子5-外显子14融合转录本[15]。NTRK上游的伴侣基因类型、NTRK基因断裂点的多样性以及RNA在FFPE样本中的提取都会限制该项技术的使用。

3.3 IHC检测

IHC检测具有成本低、检测时间短的优点，适合于临床中的筛查工作的开展。IHC检测采用的是抗广谱TRK抗体(pan-TRK)，该抗体是来自英国Abcam公司以及美国Roche/Ventana公司的兔重组单克隆抗体(EPR17341)，该抗体与TRKA、TRKB、TRKC蛋白碳端的一段保守的特有的肽序列反应。目前，文献中大部分使用来自Abcam公司的抗体，本文基于使用来自英国Abcam公司抗体的文献，阳性判定标准为至少1%的肿瘤细胞被染色，染色定位于细胞膜、细胞浆、细胞核、核周(核膜)；睾丸组织、结肠黏膜下神经丛神经节和皮质脑组织染色阳性可以作为阳性对照，而非肿瘤性淋巴细胞、肝细胞、结直肠上皮、肺泡上皮和肾皮质染色阴性可以作为阴性对照[16]。根据HECHTMAN等[16]研究发现，在20例IHC真阳性病例中，染色模式除了全部是细胞浆阳性以外，有的还同时合并核膜阳性或者胞膜阳性或者核阳性，具体如下：核纤层蛋白基因(LMNA)编码的蛋白质位于细胞核膜内表面，而LMNA-NTRK1基因融合的IHC染色模式为核膜阳性，LMNA编码的蛋白质定位与IHC染色定位一致；原肌球蛋白基因3/4(TPM3/4)编码的蛋白定位在细胞膜上，而TPM3/4与NTRK基因融合的IHC染色模式为膜阳性，TPM3/4编码的蛋白质定位与IHC染色定位一致；而肿瘤坏死因子基因(TRAF)编码的蛋白质定位于细胞膜，TRAF2-NTRK2基因融合的IHC染色模式为膜阳性，TRAF编码的蛋白质定位与IHC染色定位一致；6例ETV6-NTRK3基因融合中3例 IHC染色定位于细胞核，与ETV6基因编码的转录因子定位于细胞核一致[16]。故基于以上染色规律，HECHTMAN等[16]认为NTRK不同融合类型的特异染色模式似乎与上游融合伴侣基因编码蛋白的亚细胞定位有关。但是有关TPM-NTRK基因融合的肿瘤IHC染色模式似乎并不是一致的，HECHTMAN等[16]研究发现结直肠癌以及肺腺癌的TPM3-NTRK1基因融合IHC染色为细胞浆阳性合并细胞膜阳性；SOLOMON等[17]研究发现脂肪纤维瘤病样神经肿瘤的TPM3-NTRK1基因融合IHC染色只有细胞浆阳性；GATALICA等[18]的研究发现肺腺癌的TPM3-NTRK1基因融合IHC染色为细胞浆阳性同时合并细胞膜阳性以及细胞核阳性，而在结直肠癌中为细胞浆阳性。TPM3相关染色模式的不确定性是否与TPM3编码的蛋白的生理功能有关、是否与肿瘤类型有关还需更多实验验证。RUDZINSKI等[19]研究发现IHC染色模式与NTRK基因类型有关，NTRK1/2基因融合IHC染色仅细胞浆阳性(14/14)；NTRK3基因融合IHC染色为细胞核阳性(15/16)，可以合并细胞浆阳性，15例ETV6-NTRK3基因融合的IHC染色显示，11例细胞核阳性合并细胞浆阳性，余4例中除去1例假阴性，3例仅细胞核阳性。可以看出即使使用来自同一公司、同一克隆号的抗体，HECHTMAN等[16]与RUDZINSKI等[19]的IHC染色结果并不完全一致，差异主要体现在NTRK3上，造成此差异的原因在于细胞浆阳性判读方面，RUDZINSKI等[19]将IHC细胞浆阳性的阈值设定为50%，而HECHTMAN等[16]保持了1%的阈值。综上可以看出NTRK融合阳性的肿瘤中IHC染色模式主要定位在细胞浆，与判读标准对于阈值的设定有一定关系。目前不同研究报道的IHC染色检测NTRK融合的灵敏度和特异度分别为95.2%(20/21)、100%(22/22)[16]；96.7%(29/30)、97.9%(47/48)[19]；75%(21/28)、95.9%(3 942/4 108)[18]；87.9%(58/66)和81.1%(257/317)[17]。综合分析以上数据，IHC检测灵敏度为75%～96.7%，特异度为81.1%～100%。SOLOMON等[17]使用IHC检测NTRK1、2、3的灵敏度分别为96.2%、100%以及79.4%。据上述4篇文献[16-19]中假阴性标本的NTRK基因类型以及NTRK基因分别的IHC检测灵敏度可知，NTRK3基因融合是IHC检测灵敏度下降的主要因素。对于IHC检测的特异度而言，由于TRK一般在神经和平滑肌组织中生理性表达，因此假阳性主要出现在有着神经和平滑肌分化的肿瘤中，这些假阳性的染色模式主要是胞浆阳性或者膜阳性，而没有核阳性[17]。值得注意的是SOLOMON等[17]研究发现对乳腺癌和涎腺癌进行IHC检测的特异度分别为82%和52%，应注意这两种肿瘤假阳性的出现，对肉瘤进行IHC检测的灵敏度和特异度均较低，建议采用二代测序的方法进行检测。

3.4 NGS分析

NGS分析分为基于DNA的NGS分析和基于RNA的NGS分析。对于DNA-NGS分析而言，目前靶向panel分析有Memorial Sloan Kettering Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets(MSK-IMPACTTM)、FoundationOneCDx(Foundation Medicine)、FoundationOne©Heme及UW Oncoplex等，他们一般使用杂交捕获技术对靶基因富集之后再进行测序。研究中常使用的MSK-IMPACT的panel包括NTRK基因在内的468个基因的全部外显子以及一些选定的内含子(NTRK1的3、7～12号内含子来检测NTRK1融合,NTRK2的15号内含子来检测NTRK2融合，ETV6的4、5号内含子来检测最常见的ETV6-NTRK3融合)，NTRK3的13、14、15号内含子没有被覆盖的原因可能是其长度过长，并含有高度的重复序列。DNA-NGS分析检测NTRK基因融合的灵敏度取决于融合断裂点是否被panel所覆盖，因为断裂点通常发生在内含子区域，对于NTRK3来说，常见断裂点所在的内含子都未被覆盖，所以常会导致假阴性的发生(非ETV6的上游基因伴侣-NTRK3融合会检测不出来)。DNA-NGS分析检测NTRK融合的特异度取决于检测出的NTRK基因融合是否可以表达NTRK融合蛋白，而这往往还需要使用RNA-NGS分析进行确认。DNA-NGS分析除了可以检测基因融合，还可以同时检测基因突变、扩增(拷贝数变异)、缺失、微卫星稳定性，同时由于NTRK融合与常见的致癌改变(BRAF、RAS、EGFR等)相互排斥，因此可以根据这些常见致癌基因的状态来决定是不是要进行NTRK融合的检测。对RNA-NGS分析而言，靶向panel分析主要有ArcherFusionPlexTM、MSK Solid Fusion及MGH Solid Fusion等，他们都使用anchored multiplex PCR技术[20]，这种技术可以在NTRK上游伴侣基因未知的情况下对靶向区域富集来进行检测。这种靶向RNA-NGS的优势在于直接证实是否产生融合转录本，并且能看到相应的融合基因和断裂点处的外显子。RNA的不稳定性、易降解是RNA测序的限制因素。

3.5 NTRK基因融合检测策略

每种技术都有优点和局限性，在NTRK基因融合的筛查与确认过程中，除了合理利用上述检测方法，还要考虑肿瘤的类型，并基于NTRK基因融合与其他基因改变互斥的特点，形成检测策略情况：如果该肿瘤是一个高度富集NTRK基因融合的罕见组织学类型(如IFS、MASC、SBC以及CMN)，可以使用FISH检测NTRK3融合情况；如果该肿瘤是一个NTRK基因融合发生率较低的常见肿瘤类型，有两种选择：一是先进行IHC筛查，再对IHC染色阳性的进行NGS分析以进一步确认[21]。二是首先使用靶向DNA-NGS分析，检测结果又会出现3种情况：①检测出文献中报道过的能表达嵌合蛋白的伴侣基因-NTRK基因融合；②检测出新发现的伴侣基因-NTRK基因融合；③检测出MAPK通路中的BRAF、RAS、EGFR、ALK等基因均为野生型且NTRK基因融合阴性。针对情况①，判定为融合阳性；针对情况②和③，再进行靶向RNA-NGS分析确认[22]。

4 NTRK基因融合的靶向治疗

从曲妥珠单抗治疗HER2阳性的乳腺癌、伊马替尼治疗费城染色体阳性的慢性粒细胞白血病、吉非替尼治疗EGFR突变的肺癌到PD-1/PD-L1抑制剂帕博利珠单抗治疗高度微卫星不稳定的实体肿瘤，肿瘤的靶向治疗已经从针对特定的组织学类型的窄谱治疗过渡到了针对特定的生物标记物的广谱治疗。继PD-1/PD-L1抑制剂之后，与肿瘤类型无关的广谱抗癌药拉罗替尼(Larotrectinib)和恩曲替尼(Enrectinib)是第一代针对TRK蛋白的TKI，通过与ATP竞争性结合激酶结构域，阻碍酪氨酸残基的磷酸化，并从而阻断下游通路，发挥着抑制NTRK融合所介导的肿瘤细胞生长增殖的作用。拉罗替尼是针对NTRK基因融合的高度选择性抑制剂，而恩曲替尼是针对NTRK基因融合、ROS1基因融合、ALK基因融合的多激酶抑制剂。拉罗替尼于2018年由美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，于2019年被欧洲药品管理局批准营销授权；恩曲替尼于2019年被日本厚生劳动省和美国FDA批准上市，这两个药物都可以用于治疗携带NTRK基因融合的局部晚期的、发生远处转移的成人和儿童实体肿瘤患者，同样适用于手术切除可能导致严重并发症且无满意替代治疗方案、替代治疗后又进展的肿瘤患者；另外恩曲替尼还可以用于治疗ROS1基因融合阳性的远处转移的非小细胞肺癌成人患者。患者经第一代TRK抑制剂治疗一段时间后会产生耐药问题，耐药分为靶向耐药和脱靶耐药。靶向耐药的机制是TRK融合蛋白的激酶结构域突变，导致氨基酸的替代，这种替代主要发生在3个位置：solvent front(溶剂前沿)、gatekeeper(门卫)残基以及DFG模体[23]，然后通过在空间上阻碍TRK抑制剂和激酶的结合或改变激酶结构域的构象或改变ATP结合的亲和力引起耐药[24]。这种耐药突变与在ALK基因融合阳性、ROS1基因融合阳性的肺癌中识别的耐药突变同源[3,25]。脱靶耐药的机制主要是其他受体酪氨酸激酶的基因改变或者TRK下游通路的驱动因子的基因改变，例如MET扩增、BRAFV600E突变、KRAS热点区突变以及IGF1R的活化等。第二代TRK抑制剂Selitrectinib(LOXO-195)和Repotrectinib(TPX-0005)的出现是为了解决第一代抑制剂的靶向耐药突变问题，他们被设计成低分子量的大环状结构来容纳那些替代之后的氨基酸的大的侧链，避免空间上的碰撞[24,26]。与拉罗替尼、恩曲替尼类似，Selitrectinib是针对NTRK的高选择抑制剂，Repotrectinib是针对NTRK、ROS1、ALK的多激酶抑制剂，二者体内和体外研究结果均获得肯定，目前对应的临床试验(NCT03215511、NCT03093116)还在进行中。

5 小结与展望

被誉为“钻石突变”的NTRK基因融合作为成人和儿童肿瘤的致癌机制之一，高度富集于某些罕见肿瘤，虽然在常见的肿瘤组织类型中占比不足5%，但有效性及安全性都有不错表现的靶向药物的上市，势必给肿瘤患者的治疗手段多一种选择。随着NTRK基因融合的检测方法进一步完善，不良反应更少、耐受性更高的TRK抑制剂的进一步研发，NTRK基因融合作为靶向治疗的新靶点，正改变着肿瘤治疗的格局，为肿瘤患者带来希望。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者贡献：秦浩仁、杨向红参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The manuscript was drafted and revised byQINHaorenandYANGXianghong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.