光滑假丝酵母菌多效耐药1基因介导的氟康唑耐药机制研究进展▲

夏翠萍 张 可 王金宇 王中新

(安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥市 230032，电子邮箱：13155233015@163.com)

【提要】 氟康唑耐药率和致死率呈现上升趋势，受到学者们越来越多的关注。光滑假丝酵母菌是临床念珠菌血症重要的致病菌种，多效耐药1(PDR1)基因功能获得性突变导致外排泵转运蛋白过表达，在光滑假丝酵母菌对氟康唑的耐药机制中发挥重要作用，但目前对PDR1调节机制及突变情况的了解并不全面。本文从光滑假丝酵母菌PDR1基因介导的氟康唑耐药机制、PDR1的调控机制及PDR1功能获得性突变对菌株毒力的影响三个方面，阐述光滑假丝酵母菌PDR1基因介导的氟康唑耐药机制。

白色假丝酵母菌是临床侵袭性真菌感染的最主要病原体，但近年来，非白色假丝酵母菌感染率逐渐上升，其中光滑假丝酵母菌成为仅次于白色假丝酵母菌的常见致病性酵母菌[1]。在血液系统恶性肿瘤、糖尿病和需要肠外营养支持等患者中，光滑假丝酵母菌的感染率已超过白色假丝酵母菌[2-3]。临床上抗真菌药物种类少，三唑类药物是临床最常用的抗真菌药物，其中氟康唑具有口服效果好、毒性弱、不良反应少等优点，成为临床治疗真菌感染的一线药物。光滑假丝酵母菌是口腔黏膜的正常菌群，其具有对三唑类药物敏感性低及耐受性强等特点，因而耐药率更高，这导致光滑假丝酵母菌感染患者的临床预后较差。近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂的大量应用，光滑假丝酵母菌对三唑类药物的耐药率逐渐增加[4-5]，导致棘白菌素类药物成为治疗光滑假丝酵母菌的主要抗真菌药。但最近的研究表明，光滑假丝酵母菌对棘白菌素类药物的耐药率也逐渐上升，并且棘白菌素类耐药菌株同时也对三唑类耐药[6-7]。因此，进一步研究光滑假丝酵母菌对氟康唑的耐药机制，探索抑制耐药的新靶点，是当前亟须解决的问题。本文从光滑假丝酵母菌多效耐药(pleiotropic drug resistance,PDR)1基因介导的氟康唑耐药机制、PDR1基因的多种调控机制及PDR1基因功能获得性突变对毒力的影响三个方面，阐述光滑假丝酵母菌PDR1基因调节氟康唑的耐药机制。

1 PDR1基因介导的耐药机制

光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药的主要机制是PDR1基因发生功能获得性突变，从而导致外排泵转运蛋白的过表达[8]。外排泵转运蛋白包括三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白和主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)，其中ABC转运蛋白包括CDR1p、CDR2p和SNQ2p，其编码基因分别为CDR1、CDR2和SNQ2，ABC转运蛋白在光滑假丝酵母菌对氟康唑的耐药中发挥主要作用[9]。PDR5基因是PDR1基因与ABC转运蛋白编码基因的结合位点，PDR1基因可激活PDR5基因介导光滑假丝酵母菌对多种药物耐药。CgPdr1p为锌簇DNA结合区域转录因子，参与下游基因的转录调控，PDR反应元件(PDR response elements，PDRE)包括PDRE1和PDRE2，位于PDR1基因序列的上游，在调节PDR1基因介导的耐药方面，PDRE2作用大于PDRE1[10]。CDR1、CDR2、SNQ2基因序列同样包含PDRE，启动子通过结合CDR1、CDR2、SNQ2基因序列上的PDRE介导氟康唑的外排作用。敲除PDRE可增加光滑假丝酵母菌对氟康唑的敏感性[10]。PDR1基因通过激活下游靶基因CDR1、CDR2、SNQ2过表达介导外排泵耐药，其中CDR1在外排泵耐药中起主要作用，CDR2的作用次之，SNQ2的作用较小[11-12]。Whaley等[13]研究发现，与敲除ABC转运蛋白上的CDR1、CDR2、SNQ2基因相比，敲除PDR1基因后光滑假丝酵母菌对氟康唑的敏感性更高，提示PDR1基因不仅可以通过功能获得性突变介导下游外排泵转运蛋白编码基因CDR1、CDR2、SNQ2过表达，从而引起病原体发生耐药。PDR1基因还可能通过其他途径介导氟康唑耐药机制，但需进一步研究。

2 PDR1基因的调控机制

PDR1基因是光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药的中心调控因子，主要通过以下3个方面发挥作用：(1)与氟康唑直接结合[14]，即PDR1基因可以直接与氟康唑结合，导致光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药；(2)引起光滑假丝酵母菌的线粒体编码基因缺失，使得线粒体功能障碍，导致ABC转运蛋白表达上调[15]；(3)PDR1基因发生功能获得性突变。PDR1基因功能获得性突变介导的外排泵蛋白过表达是光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药的主要原因。PDR1基因功能获得性突变产生的氨基酸替代性突变上调下游靶基因，是CDR1过表达介导耐药的主要机制之一。光滑假丝酵母菌PDR1基因与酿酒酵母菌PDR1基因、PDR3基因的同源性很高[16]，虽然与酿酒酵母菌PDR3基因同源性更高，但是其调控功能(为自动调控)更接近于酿酒酵母菌PDR1。PDR1基因的功能区域主要有3个部分：羧基末端(即激活区)、中间同源区(middle homology region，MHR)和DNA结合区。PDR1基因的功能获得性突变主要发生在羧基末端和MHR[17]，转录共激活因子MedA15通过激酶诱导结合域与PDR1羧基末端结合，在PDR1基因介导的转录激活中发挥重要作用。研究发现，对羧基末端三倍体进行修饰可以提高光滑假丝酵母菌对氟康唑的敏感性，而对羧基末端一倍体和PDR1氨基端进行修饰则降低了光滑假丝酵母菌对氟康唑的敏感性[18]，可能原因是羧基末端三倍体修饰改变了PDR1的细胞定位，使PDR1基因从细胞核转移到细胞浆，从而使PDR1基因的自动调控功能降低。敲除MHR会使光滑假丝酵母菌处于一种高毒性的状态[17]，在这种情况下光滑假丝酵母菌可因不能耐受自身毒性而死亡。说明光滑假丝酵母菌的PDR1基因即使在发生功能获得性突变后仍存在负调控，否则光滑假丝酵母菌会产生毒性导致自身死亡，而这种功能获得性突变超过了PDR1正常的负调控或者改变了具有负调控功能的蛋白的结构，从而导致耐药的发生。PDR1的功能获得性突变主要是通过激活下游靶基因CDR1介导耐药的发生，但Simonicova等[19]发现PDR1基因的羧基末端发生的两个突变，即D1082G和LWG1079AA位点突变，并不是严格意义上的功能获得性突变，因为D1082G和LWG1079AA位点突变可降低光滑假丝酵母菌的耐药性。

麦角固醇生物合成途径在光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药方面也发挥重要作用，氟康唑的抗菌作用机制主要是通过与14α-去甲基化酶结合，抑制光滑假丝酵母菌细胞膜脂质的合成，从而起到抑制真菌生长作用。麦角固醇11是麦角固醇生物合成途径的编码基因，其通过编码关键酶14α-去甲基化酶来调节细胞膜脂质的合成。Upc2是麦角固醇通路的主要调节因子，Upc2通过促进麦角固醇11的合成维持细胞膜脂质的正常结构和功能[20]。Vu等[21]发现，当麦角固醇11活性受抑制(如氟康唑处理)时，Upc2通过结合麦角固醇11、PDR1、CDR1启动子，从而参与PDR1基因介导光滑假丝酵母菌对氟康唑的耐药。由此可知，Upc2是连接麦角固醇生物合成和PDR1基因调控外排泵耐药协同作用的中间调节因子。Jjj1和Bre5是PDR1基因的负调节蛋白[22-23]。敲除剂量依赖性敏感的光滑假丝酵母菌株的Jjj1基因会导致光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药，且ABC转运蛋白CDR1p和CDR2p表达量分别增加16倍和4倍，而Snq2p的表达没有显著改变[22]。虽然Jjj1可通过抑制PDR1基因介导的CDR1激活来参与光滑假丝酵母菌对氟康唑的耐药，但仍有部分PDR1基因不受Jjj1的影响。Bre5是去泛素化酶复合物的组成部分，与泛素化特异性蛋白酶Ubp3共同参与蛋白质的泛素化修饰，Bre5和Ubp3组成的复合物参与转录因子TFⅡD和RNA聚合酶Ⅱ的泛素化[24]，Bre5可抑制PDR1基因对CDR1的激活，这表明PDR1可能受泛素化修饰作用的调节。

3 PDR1基因功能获得性突变对光滑假丝酵母菌毒力的影响

PDR1基因的功能获得性突变可增强光滑假丝酵母菌的毒力和侵袭力，与感染野生菌株相比，感染PDR1基因突变的光滑假丝酵母菌的小鼠的组织损伤程度加重、脏器感染的菌量明显增加，并且不同的功能获得性突变对光滑假丝酵母菌毒力的影响并不相同[25-27]。由此可见，PDR1基因发生功能获得性突变后光滑假丝酵母菌具有更强的致病性。EPA1是一种编码黏附素的基因。研究发现，PDR1基因的功能获得性突变增强了光滑假丝酵母菌对上皮细胞的黏附力，同时EPA1基因的表达量也发生了上调，表明PDR1基因的功能获得性突变可能通过上调黏附基因EPA1的表达从而增强光滑假丝酵母菌的毒力[28]。但Tian等[29]却研究发现，PDR1 基因的G346D位点发生功能获得性突变后反而降低了EPA1基因的表达和光滑假丝酵母菌对上皮细胞的黏附作用。但目前对PDR1基因功能获得性突变的研究有限，并且对于多位点发生突变后光滑假丝酵母菌的毒力如何变化，也了解甚少。根据上述文献，D1082G和LWG1079AA位点突变可降低光滑假丝酵母菌的耐药性，但这两个位点突变对黏附性又产生何种影响，光滑假丝酵母菌PDR1基因发生不同功能获得性突变后其耐药性和对宿主细胞的黏附力的影响是否一致，都需要进一步的研究。

综上所述，PDR1基因在光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药中发挥重要作用，但目前对PDR1基因调控机制的研究并不全面，PDR1基因在发生单个位点或多个位点功能获得性突变后光滑假丝酵母菌的耐药性和毒力如何变化，仍需进一步探究；同时，探寻新的PDR1基因负性调节因子也是未来研究的重点。但光滑假丝酵母菌对氟康唑耐药涉及多种机制，是一个多水平作用、多因素调节的复杂过程，单个耐药基因不能完全解释光滑假丝酵母菌的耐药机制，仍需要进一步研究以了解更多的耐药机制。