共固定化葡萄糖氧化酶研究进展*

2023-01-04高丰琴何玉梅安红婷

化学工程师 2022年1期

高丰琴，何玉梅，安红婷，牟萱

（咸阳师范学院化学与化工学院，陕西咸阳 712000）

葡萄糖氧化酶可催化氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，然后水解为葡萄糖酸和H2O2。该方法检测葡萄糖具有灵敏度高、准确、快速的特点[1]，而且，反应中产生的H2O2可以在级联酶反应中做氧化剂[2]。近年来，葡萄糖氧化酶法已被广泛用于临床、食品、生物技术、化学合成等行业中[3]。但游离酶在高温和强酸强碱等环境下很容易因失活而导致催化效率降低，且反应后难于回收重复利用。而固定化酶则可以提高酶的操作稳定性、在反应体系中容易实现与底物或产物的分离，可实现多次重复使用，从而提高其经济效益，有利于可持续发展[4]。与单酶固定化相比，葡萄糖氧化酶的共固定化由于可以将两种酶的催化特性结合起来，充分发挥每一种酶的特点甚至利用级联反应的协同作用，而使酶的催化效率得以提高，具有广阔的工业应用前景[5]。

1 葡萄糖氧化酶与氯过氧化物酶的共固定化

双酶共固定化，需要选择合适的固定化载体，并采用合适的固定化方法来实现双酶的固定并达到预期的功能。Yildirim Nimet等[6]在玻璃基板上采用溶胶-凝胶包埋法固定化葡萄糖氧化酶（GOx）和氯过氧化物酶（CPO），并用于检测一种pH敏感荧光染料。在磷酸盐缓冲pH值为7.0溶液中，反应体系的荧光强度与浓度在1.0～30mM范围内的葡萄糖呈线性相关。相比游离酶GOx/CPO，溶胶-凝胶包埋酶的检测灵敏度较高，该研究方法可用于某些饮料中葡萄糖的分析。Campbell Alan S.等[7]以GOx为工作酶、与CPO共固定在羧基功能化的多壁碳纳米管（MWNT）上，通过GOx酶促反应产生的H2O2可以进一步作为底物被共固定化的CPO转化为HOCl。研究结果发现，CPO-MWNT-GOx（CPO共价、GOx吸附）双酶反应体系中HOCl的速率明显大于GOx-MWNT-CPO（GOx共价、CPO吸附）双酶反应体系。该双酶体系设计根据特定功能将给定的酶排列到相同的纳米载体上，使其在纳米生物界面上的连续酶促反应成为生物传感器应用的可行性。

许多工业生产过程可以是由两种或两种以上的酶以级联方式协同工作来催化，但设计高效的酶级联反应仍然是一个挑战。2000年，Velde Fred van de等[8]在聚氨酯薄膜上通过共价键与载体相连实现CPO和GOx的共固定，并通过GOx氧化葡萄糖产生的H2O2作氧化剂、CPO做催化剂进行光学异构性反应苯硫基甲烷磺化氧化。固定酶的操作稳定性较好，催化氧化转化率达到100%，e.e.值达99%。Jung Dirk等[9]将GOx和CPO的交联酶聚集体分别固定于大孔-介孔材料MCF中，并通过GOx氧化葡萄糖在线产生的H2O2实现吲哚的氧化反应（在CPO催化下）。在固定床反应器中，进行的连续操作条件下的催化试验证实，与MCF或SBA-15孔中物理吸附的酶相比，在MCF中的交联酶不易泄漏。通过调控十六烷基三甲基溴化铵的用量合成的具有介孔结构的TiO2薄膜，依据CPO和GOx不同分子大小合理设计孔径尺寸以形成有序的“占位”效应，可以抑制酶的聚集，避免酶活性的降低[10]。当CPO和GOx共同固定在同一载体上时，与等摩尔的游离酶混合物相比，初始催化效率提高了4倍。此外，根据动力学分析，酶对底物结合的亲和力得到了提高。与游离酶相比，TiO2-GOx和CPO复合材料的热稳定性有了很大提高。TiO2-GOx和CPO复合材料可以很容易地从反应介质中分离出来，这有助于其循环使用。这种高效的固定化双酶对于固定床酶连续反应操作是一个很有前景的策略，可用于进一步评估预期的工业应用。

2 葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的共固定化

目前，实现活性固定化多酶生物催化剂在体外进行多步级联反应的实现是一个极具挑战性的课题。Pitzalis Federica等[11]以3-氨丙基三乙氧基硅烷功能化SBA-15材料为载体，用戊二醛共价法共固定化GOx和辣根过氧化物酶（HRP）。共固定化双酶体系中，GOx氧化葡萄糖产生H2O2，用HRP催化氧化ABTS反应。无论采用何种固定化策略，结果表明，只有保持固定化的双酶生物催化剂保持湿润，才能保持催化活性。湿润的HRP@SBA-15和干燥的GOx@SBA-15在循环使用6次后活性损失较高，湿润的GOx/HRP@SBA-15生物催化剂可循环使用14次仍保持良好的催化活性。用双酶生物催化剂对农业废水中的两种酚类污染物（咖啡酸和阿魏酸）进行了氧化试验，生物催化剂在15min内转化率可达70%。

Ahmad Raneem等[12]将GOx和HRP共固定化于金属有机物骨架（MOF）UiO-66和UiO-66-NH2，并用于邻苯三酚的氧化反应。选择两种MOF作为固定化酶载体，主要研究MOF连接体的修饰如何影响酶/MOF界面的稳定性和酶体系的后续活性。结果显示，两种酶/MOF体系的催化活性增强，表明金属有机骨架固定化酶可以提高协同体系反应活性。与HRP/GOx@UiO-66相比，在HRP/GOx@UiO-66-NH2中的偶联剂功能化提高了酶的固载量、活性和稳定性。酶固载量和稳定性的增加可能是由于胺基增加了MOF表面的静电吸引力。这项研究从结构和功能关系分析，为更好地设计生物催化剂提供了理论研究基础。

将GOx和HRP双酶被包埋在聚乙烯亚胺（PEI）中，然后固定于碳纳米管和芘硼酸组成的基底上[13]。这种结构被认为是葡萄糖生物燃料电池（GBFC）的阴极催化剂。通过对催化剂性能的评价，发现PEI中的双酶包埋良好，基底通过形成π-π堆积和缩短电子转移路径来促进电子转移，从而提高了氧还原反应的催化活性。当采用该催化剂操作膜GBFC时，可获得较高的功率密度、良好的储存稳定性和较高的葡萄糖消耗率。可见，双基底共固定化酶阴极催化剂对提高GBFC的催化活性和性能起到了主导作用，而且GOx-HRP-PEI的复杂结构防止了酶分子的变性。

Alim Samiul等[14]报道了一种新型的葡萄糖生物传感器，该传感器将GOx和HRP与SnO2聚合多孔纳米纤维共同固定在壳聚糖玻碳电极上。以具有高比表面积和良好导电性的锡前驱体为原料，采用静电纺丝法制备了SnO2多孔纳米纤维，并与聚苯胺进行了聚合。聚合后的纳米纤维在促进固定化酶的电活性中心与电极表面之间的直接电子转移方面起着重要作用。所制备的生物传感器的安培响应与葡萄糖浓度呈长程线性关系，而且生物传感器响应速度快、检测限低、具有长期稳定性和重复性。聚合的多孔纳米纤维SnO2有望成为生物传感器中一种很有前景的纳米材料。通过将GOx和HRP共固定在Ketjen Black修饰电极上，Xia Hongqi[15]等构建了一个双酶电极，将GOx的氧化酶反应与HRP作用下的H2O2的直接电子转移型生物电催化还原耦合起来，葡萄糖的安培检测灵敏度高、检测限低，而且对于生物燃料电池中的生物阴极，固定化双酶非常具有优势。

可穿戴电化学生物传感器以非侵入性的方式测量生物流体中生物化学小分子的浓度，仍然是人们迫切需要的。Xia Hongqi等[16]利用导电柔性碳纳米管-乙烯-醋酸乙烯酯薄膜的层状结构，在酶电极界面成功地实现了HRP的直接电子转移。通过将GOx和HRP共同固定在这种多孔CNT-EVA薄膜上，进一步制备了具有（270±10）μA·（mM·cm2）-1超高灵敏度的无介质可穿戴葡萄糖生物传感器。由于其高导电性和与皮肤的良好相容性，因此，具有较高的信号背景灵敏度。实验结果表明，该传感器能够同时监测汗液葡萄糖和表面肌电信号，为今后健康监测、早期诊断和临床研究提供多种生理信号。

3 葡萄糖氧化酶与其他酶的共固定化

张柳[17]以Cu3（PO4）2为无机组份，通过结合GOx的催化专一性和脂肪酶的催化非专一性，构建了一种GOx和脂肪酶双酶纳米花共固定化酶，并将固定化双酶用于催化烯烃类化合物环氧化反应。由于纳米花这种特殊的固定化酶方式，GOx和脂肪酶双酶负载率可达100%。与游离双酶相比，纳米花共固定化双酶具有更高的催化活性、稳定性和可重复利用性。

惠明等[18]制备出一种HNO3-H2SO4法改性的碳纤维（CF）优良固定化酶载体，并用于共固定化GOx和过氧化氢酶（CAT）。双酶配比GOx∶CAT活力比1∶2、戊二醛交联剂体积分数0.2%、交联时间15min，固定化双酶的酶活回收率为30.6%。固定化酶的性能如热稳定性、pH稳定性、贮藏稳定性等均有显著提高。重复使用性方面，连续使用10次后固定化酶残留酶活为初始酶活的72.4%。该研究反应条件温和，为固定酶生产葡萄糖酸盐工业应用提供了新思路。

Long Jie[19]采用溶胶-凝胶包埋法对GOx和β-呋喃果糖苷酶进行了共固定化，并对其后续的蔗糖生产效率进行了研究。共固定化后，酶活力保持85.39%，且固定化双酶具有良好的操作稳定性，连续重复使用15次后，其初始活性保持在78.5%以上。在优化的条件下，固定化双酶法合成的蔗糖收率提高到160.8g·L-1，比文献报道的要高。溶胶-凝胶共固定化GOx和β-呋喃果糖苷酶具有稳定性高、可重复使用等优点，在连续蔗糖生产中显示出巨大的工业应用潜力。