ATRX新致病性变异致X连锁智力低下家系分析

金孝华 安莉莎 闫有圣 张 璐 曹小芳 马 旭 于晗澍

1.国家卫生健康委科学技术研究所(北京，100081)；2. 国家人类遗传资源中心；3. 首都医科大学附属北京妇产医院；4. 菏泽市立医院

X连锁智力低下综合征(XLMR)是一组高度异质性的先天性缺陷和智力发育异常，在男性患者中的发生率约为1/600，仅次于唐氏综合征的发生率[1]。目前已经报道的XLMR致病基因有90余个[2]。α地中海贫血X连锁智力障碍(ATR-X)综合征是一种罕见的XLMR，主要特征为智力低下、特殊面容、发育迟缓、身材矮小、小头畸形、伴或者不伴有轻型α地中海贫血，ATRX基因突变是导致ATR-X综合征的遗传学因素[3]。笔者对于一个X连锁智力低下家系进行了临床表型分析，经全外显子组(WES)测序及家系突变分析，明确ATRX基因突变导致了该家系ATR-X综合征。

1 资料和方法

1.1 家系资料

核心家系父母正常，生育二男一女，两男孩子患病，女孩正常(图1，492页)。先证者(Ⅱ3)男，3岁，因孕36+2周胎心监护异常剖宫产，出生体重2.77kg，出生后诊断为“早产儿脑病”。头颅MRI显示：双侧大脑多发皮层下脑白质异常信号，给于康复治疗。身高89.7cm，体重13.5kg，头围49.0cm，经《0～6岁小儿神经心理发育量表》评估，发育商数(DQ)81.1，中度发育迟缓。血常规检查结果显示，红细胞计数(RBC)4.38×1012，血红蛋白(HGB)116g/L，红细胞比容(HCT)34.80%，平均红细胞体积(MCV) 79.50fl，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)26.50pg，诊断为小细胞低色素贫血。患儿有特殊面容：眼距宽、内眦赘皮、鼻梁低平、人中长、鲤鱼样嘴、厚嘴唇、V型上唇；生长发育迟缓；语言发障碍。先证者同胞哥哥(Ⅱ1)15岁，智力低下(IQ=43)，血常规检查正常，RBC 5.16×1012，HGB 149g/L，HCT 43.70%，MCV 84.70fL，MCH 28.90pg。特殊面容，6岁时频发性癫痫。脑电图提示双侧枕区不同步棘慢波，多棘慢波接近连续发放，右侧显著，给予抗癫痫药物控制。先证者姐姐(Ⅱ2)、父(Ⅰ1)母(Ⅰ1)均无相关表型。遵循知情同意的原则，签署知情同意书后，采集先证者同胞兄姐及父母外周血用于基因检测。

1.2 研究方法

1.2.1DNA提取采用基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGEN，German)提取先证者及家系成员全血基因组DNA，严格按照试剂盒说明书进行。用核酸定量仪(Qubit2.0，Invitrogen)进行基因DNA定量和纯度测定。

1.2.2全外显子组测序分析证者基因组DNA经定量后采用全外显子组捕获试剂盒(SureSelect Human All Exon V5，Agilent)捕获全外显子组，并进行高通量测序试剂盒进行文库构建，在高通量测序仪(HiseqX10，Illumina)上进行全外显子组测序。测序片段通过BWA软件(版本：0.7.9a)与UCSC hg19参考基因组进行比对，采用GATK(版本：v3.2)进行变异识别和分型，采用VEP软件(Variant Effect Predictor, Ensembl 73)进行注释。参考变异数据库ClinVar、OMIM 和HGMD筛选已知的致病变异，同时采用多种工具预测错义变异的功能以及非编码调控序列的注释。依据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)发布的《序列变异解读标准和指南》对每个变异进行分类[4-5]。序列变异使用人类基因变异国际命名系统(HGVS)进行变异命名和注释[6]。

1.2.3家系成员Sanger测序验证生物信息学分析获得的候选致病基因突变位点，在其周围设计上下游扩增引物，PCR反应后获得目标区域产物，采用BigDye3.1(ABI)测序试剂盒进行测序反应，产物经乙醇沉淀法纯化后在ABI3500DX测序仪上进行序列分析。

2 结果

2.1 先证者全外显子组测序结果

先证者全外显子组测序产出原始数据为12.5G，目标捕获区平均测序深度为101.98×，≥1×测序深度下的覆盖度为98.05%，≥4×为97.92%，≥10×为97.15%，≥20×为95.43%，数据量符合实验设计要求。测序数据经生物信息学分析，先证者在ATRX基因外显子3检测到NM_000489.3:c.161_162del(NP_000480.2:p.Ser54Ter)半合子变异。该变异在正常人数据库1000 Genomes、ExAC、gnomAD均未见记录，属于罕见的变异；ClinVar、OMIM和HGMD数据库未见致病性报道。

2.2 家系成员验证

采用Sanger测序验证家系成员中ATRX基因c.161_162del变异，结果显示先证者父亲为野生型，母亲为杂合突变携带者，患病的哥哥与先证者相同，属于半合子变异，姐姐和母亲相同属于杂合突变携带者(图2，492页)，该遗传方式符合X连锁遗传方式。

2.3 变异致病性分析

ATRX基因c.161_162del变异属于缺失变异，ATRX基因的密码子发生框移，导致编码蛋白的第54位丝氨酸(Ser)变为终止密码子(Ter)，产生了没有功能的截断蛋白(PVS1)；该变异在正常人数据库均未见频率报道(PM2)；家系分析复合共分离的模式(PP1)；患者表型与ATR-X综合征高度符合(PP4)。根据ACMG变异分类标准与指南，ATRX基因c.161_162del变异属于致病性变异(PVS1+PM2+PP1+PP4)。

3 讨论

ATRX基因定位于Xq21.1，包含有36个外显子，基因全长跨越300kb，编码2492个氨基酸的ATRX蛋白，参与DNA重组、修复转录调控的等，是DNA解旋酶家族SWI/SNF的成员。ATRX蛋白包含多个功能结构域，N端有一个富含半胱氨酸的区域，该区域包括一个C2-C2和PHD样锌指结构域，还有一个ATP酶/解旋酶结构域，该结构域主要控制转录调控、细胞周期调控和有丝分裂染色体分离。ATRX的中心部分包括一个预测的卷曲-卷曲结构域，一个预测的核定位信号和21个谷氨酸残基。ATRX蛋白的C末端是一个不同于SNF2蛋白的保守区和一个谷氨酸富集区[7]。ATRX蛋白在个体发育过程中发挥广泛的生物学功能，在大脑、心脏及骨骼肌高表达，ATRX基因突变导致蛋白功能异常，从而导致了患者出现复杂表型的X连锁的智力低下综合征。

ClinVar数据库已经收录的ATRX基因变异达到200余种，其中主要是错义突变，其中50%的突变C端的富含半胱氨酸的区域，30%位于SNF2样解旋酶结构域[7]。但是与ATP酶/解旋酶结构域突变患者相比，具有PHD样锌指结构域突变的患者表现出更严重的表型[8]。本研究对一个X连锁智力低下家系进行了全外显子测序，发现先证者和患病的同胞哥哥存在ATRX基因NM_000489.3:c.161_162del，该变异位于PHD样锌指结构域，产生了ATRX蛋白的截断，先证者和其哥哥表现典型的ATR-X综合征表型，智力低下、特殊面容。Basehore等[9]报道了5个家系中存在无义突变c.109C>T(p.R37X)，患者产生ATR-X综合征的表型，但是总体表型比较温和，尽管突变位点位于ATRX基因外显子2，但是蛋白的功能似乎可以通过替代转录本的产生或者通过其他的分子机制部分挽救。

ATR-X综合征血液系统的表现存在可变表型，约75%的患儿表现出α-地中海贫血的特征[10]。先证者有轻度的小细胞低色素贫血，考虑伴有α-地中海贫血的表型，但其哥哥血常规检查正常。有文献报道Smith-Fineman-Myers综合征的大多数儿童期表现会更加典型，成年后部分表型有可能消失[11]，所以其哥哥并没有表现出地贫的特征。

由于ATR-X综合征的表型特征在不同家系中存在不一致性，WES技术大大提高了诊断效率，明确基因突变。ATR-X综合征属于X连锁遗传方式，患者主要是男性，女性携带者由于X失活一般无表型。先证者母亲是ATRX基因杂合变异携带者，再次生育有50%的概率将突变遗传给男性后代。如家族中发现ATRX基因致病变异，对高危女性进行携带者检测，并进行产前诊断或者植入前基因学检测(PGT)[12]，可以阻断ATR-X综合征患者的出生。