精子活性氧类物质与其形态及DNA碎片的相关性

宋晓庆 李采霞 潘小红 杨春燕 彭晓旭 张艳茹 高文怡 邓 云

中国人民解放军联勤保障部队第904医院(无锡，214000)

不孕(育)症已成为一个全球性问题，并且有逐年增加趋势[1-2]。虽然辅助生殖技术(ART)已成为解决不孕(育)症的有效手段，但临床成功率远未达到预期[3-4]。在不孕不育因素中，男性不育因素近50%[4]。男性不育主要与精子质量有关，精子质量易受如缺乏微量元素、疾病和感染因素、药物、毒物和辐射损伤、氧化应激、年龄、精神因素、不良生活习惯(吸烟、饮酒等)等多种因素的影响[5]。在导致男性不育众多因素中，精子氧类活性物质(ROS)受到了广泛关注，活性氧诱导的精子氧化应激损伤理论成为近年研究热点[6-7]。本研究探究ROS与精子形态畸形及精子DNA损伤的可能关系，为男性不育症抗氧化治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年8月-2020年8月在本院就诊的男性不育患者精液标本250例。纳入标准：①近期无严重的生殖系统感染，无激素类药物服用史，无外伤及遗传性家族史；②肝肾功能正常、无全身器质性、急慢性疾病；③染色体正常：46，XY，近半年内未受到X线等辐射影响，体检未发现睾丸、附睾、输精管异常，无精索静脉曲张。所有患者均签署知情同意书，本研究通过伦理委员会批准。

1.2 标本采集

男方禁欲3～5d，手淫法收集精液，37℃孵育30min液化后室温下梯度离心，弃上清收集沉淀，用Ham'sF-1培养基洗涤精子2次；弃上清收集沉淀，加入Ham'sF-10+BSA3.5mg/ml(9:1)培养基，调整精子密度至20×106/ml，轻轻搅拌，制备精子悬液备用。

1.3 观察方法

1.3.1精子形态学分析参照第五版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》采用改良巴氏染色法，每张涂片至少计数分类200个精子，对精子头部、颈部、尾部形态进行评判，对精子头部、颈部、尾部形态畸形以及混合畸形进行分组，计算正常形态精子百分率与异常形态[8]。

1.3.2精子DNA完整性分析采用染色质扩散法(SCD)检测精子核DNA损伤程度。具体方法参照Sperm Fun DNA试剂说明书，精子DNA碎片指数(DFI)判断：精子头部只产生小晕或无晕，单侧晕厚度不能超过精子头部最小直径的1/3。在高倍显微镜下至少观察到500个精子，计数含有DNA片段的精子数。精子DNA碎片指数(DFI)=(存在DNA碎片的精子数量/计数的精子总数)×100%。

1.3.3精子ROS检测采用上海杰美生物制剂公司生产的精子活性氧化学发光检测试剂盒，采用鲁米诺化学发光法检测。

1.3.4实验分组根据精子DFI分为<15%、15%～30%、>30% 3组；按照第五版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》参考值将正常形态精子≥4%分为正常组，<4%为异常组。分析不同形态精子及精子DFI组间精子ROS水平关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0统计学分析。符合正态分布时，计数资料均采用卡方检验，相关性分析采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同精子形态学组间精子ROS水平

入组患者250例中精子形态正常占60.4%(151/250)，异常占39.6%(99/250)；精子形态异常中，头部畸形47.5%%(47/99)，颈部畸形35.4%(35/99)，尾部畸形为13.1%(13/99)，混合畸形4.0%(4/99)，各畸形占比逐渐降低(P<0.05)。精子ROS水平，精子形态正常组(462.76±148.76 U/L)低于头部畸形组(715.49±203.82 U/L)、颈部畸形组(711.39±206.24 U/L)、尾部畸形组(718.83±201.57 U/L)、混合畸形组(721.31±200.67 U/L)(t=9.262、8.235、5.779、3.404，P<0.05)，而各畸形组间无差异(均P>0.05)。

2.2 不同DFI值组精子ROS水平

分析比较，精子DFI<15%、DFI 15～30%、DFI>30%占比逐渐降低，分别为55.6%(139/250)、32.4%(81/250)、12.0%(30/250)(t=7.832、8.030、2.035，均P<0.05)；DFI>30%组精子ROS水平最高(719.74±205.39 U/L)，其次为DFI 15～30%组(637.24±183.65 U/L)和DFI<15%组(457.68±151.46 U/L)(F=46.417，P=0.000)。

2.3 精子形态学、精子DNA碎片与精子ROS水平相关性

Pearson相关性分析，精子形态正常率与精子ROS水平存在负相关(r=-0.345，P=0.000)，头部畸形(r=0.242，P=0.009)、颈部畸形(r=0.167，P=0.008)、尾部畸形(r=0.128，P=0.043)发生率均与精子ROS水平存在正相关(P=0.05)；精子DFI值与精子ROS水平存在正相关性(r=0.341，P=0.000)。

3 讨论

精子ROS可帮助维持男性正常生殖生理功能，与男性不育存在一定关系。以往研究认为，ROS在精子发育过程中具有两面性，正常生理剂量对精子获能、精子活力以及顶体反应具有重要影响。当男性机体抗氧化体系失常，机体产生氧化应激反应时，精子会发生病理改变，如精子膜被破坏、精子成熟障碍、精子活力降低、线粒体功能障碍等，最终可能会导致精子死亡[9-11]。以往评估精子质量时多采用精子常规检查，近年有学者通过精子DFI值评价精子质量取得较好应用价值[12]。另外，有研究显示正常形态精子占比对预测女方受孕概率有一定价值，且与受孕时间具有关联性[13]。

在本研究中，250例入组患者中精子形态正常占比60.4%，精子形态异常中头部畸形、颈部畸形、尾部畸形、混合畸形占比逐渐降低，精子形态异常各畸形组精子ROS水平无差异但均高于正常组。说明本组患者精子畸形率较高，且精子畸形者精子ROS水平更高。既往研究显示[14-15]，形态异常精子伴随产生大量活性氧，异常形态精子是产生氧自由基的主要来源之一，精子异常形态与精子ROS可能存在一定关系。本研究经相关性分析发现，精子ROS水平与精子正常形态率呈负相关，与头部畸形、颈部畸形、尾部畸形发生率均呈正相关，且以头部畸形的相关性最高，具体原因有待进一步研究。

本研究显示，精子DFI<15%、DFI 15～30%、DFI>30%患者精子ROS水平逐渐升高，表明ROS水平高的精子更有可能含有DNA片段。分析认为：精子膜不饱和脂肪酸含量高，自身抗氧化能力弱，在过量活性氧攻击下易发生脂类过氧化反应，而DNA碱基对氧化应激敏感，这些结构的过氧化作用可导致碱基修饰、DNA链断裂和染色质交联，导致精子DNA片段增加。本文分析精子DFI值与精子ROS水平存在正相关性，也提示精子DNA损伤可能是由于精液中氧化应激反应造成的[16-17]。

综上所述，异常形态精子可能是产生氧自由基的重要来源，而高水平精子ROS与精子DNA碎片增多可能有关，它会加速生殖细胞的凋亡、导致受精率降低等一系列不良后果。